Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)在鸡胚中的增殖及感染力的测定

为确定所分离Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)毒力,为DHV单克隆抗体研究做好前期准备。将Ⅰ型鸭肝炎病毒接种于9日龄SPF鸡胚尿囊腔(0.2 mL/胚)进行增殖,制备鸡胚成纤维细胞(CEF),并分别运用鸡胚半数致死量(CELD50)法和组织培养半数感染量(TCID50)法测定DHV的感染力。结果显示,DHV-Ⅰ在SPF鸡胚内成功增殖,致死鸡胚具有典型临床症状和体表特征,所增殖病毒的CELD50和TCID50分别为10-5.6/0.2 mL和10-5.12/0.1 mL。结果表明,该分离毒株毒力较强,是进行DHV单克隆抗体研究的理想抗原。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因克隆与序列分析

为了了解鸭肝炎病毒的遗传变异情况,试验采用RT-PCR方法对采自广东省各地12个DHV临床分离株的VP1基因进行了扩增、克隆、测序和序列分析.结果表明,12个DHV分离株的VP1基因序列长度均为714 bp,编码238个氨基酸,12个分离株与GenBank公布的参考株核苷酸同源性为91.7％～95.8％,氨基酸同源性为94.5％～98.3％,而12个分离株之间的核苷酸序列同源性达到99.2％～100％,氨基酸同源性为97.9％～100％.系统分析证明,12个DHV分离株均为DHV-Ⅰ型,不同分离株VP1基因无碱基插入和缺失,但存在点突变,各DHV分离株间亲缘关系较近,但存在一定的遗传差异.

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了一对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的RT-PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到了预期大小为699 bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的DHV-Ⅰ的相应基因序列比对分析,同源性均达90%以上,表明为DHV-Ⅰ的基因序列,对NDV,IBDV,DPV和GPV等常见病毒扩增结果为阴性。该方法敏感性检测结果表明,最低RNA模板检出量为24 pg。表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于I型鸭病毒性肝炎病毒的快速诊断。

鸭肝炎病毒Ⅰ型的RT—PCR诊断方法的建立

根据Genebank上发表的鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-1)的部分序列设计了1对引物D1/D2,通过对反应条件的优化,建立起了有效的鸭肝炎病毒Ⅰ型的RT-PCR诊断方法。并应用此方法对近年在上海及周遍地区分离到的2株DHV-1分离毒进行了检测和测序鉴定,结果证实此株分离毒为DHV-1病毒。结果显示建立的DHV-1的PCR诊断方法具有快速、准确的优点。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒一步法RT-PCR诊断方法的建立及初步应用

根据GenBank中发表的I型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-I)的3D基因设计一对引物,用实验室分离培养的毒株提取病毒RNA进行RT-PCR扩增,得到预期大小的目的片段。试验结果表明,所建立的RT-PCR方法最低模板检出量为50pg,且该方法只能特异地检测出鸭病毒性肝炎病毒,不能检出鸭瘟病毒(DPV)、禽流感病毒(AIV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)等。该方法也能成功检测出人工感染发病死亡雏鸭的肝脏和脾脏。结果表明,该方法可用于DHV-Ⅰ的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。

Ⅰ型鸭肝炎病毒的研究进展

鸭病毒性肝炎是鸭的五大传染病之一,由于近年鸭肝炎(Ⅰ型)发病率的不断上升,以及变异株的不断出现,养鸭比较集中的地区都遭受了巨大的经济损失和严重的威胁。随着病毒基因组的测序的完成,为该病毒的研究有了一些新的认识和思路。本文从病毒的流行病学、基因组结构和功能以及病毒的检测方法等方面,阐述了DHV-I的最新研究进展,为该病的防治提供理论基础。

Ⅰ型鸭肝炎病毒RNA聚合酶基因的克隆及原核表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV-Ⅰ）ZJ-Ⅴ株基因组序列（GenBank登录号：EF382778）,设计了一对扩增RNA聚合酶基因（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的特异性引物,以ZJ-Ⅴ株基因组为模板,扩增DHV-Ⅰ的RdRp基因。运用DNAStar软件对ZJ-Ⅴ株病毒与GenBank上已发表的其他不同DHV毒株的RdRp基因序列进行同源性比较和遗传进化分析,结果表明,ZJ-Ⅴ株与A型DHV-ⅠR85952株（DQ226541）的同源性为97.1%,亲缘关系最近,与2株台湾新型（B型）DHV之间为76.9%和77.0%,与C-GY株和4株韩国新型（C型）DHV株之间为76.2%~76.5%,亲缘关系较远。将RdRp基因克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,获得重组表达质粒pET-RdRp,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示RdRp蛋白分子量约为65 kDa,Western blot检测证明RdRp蛋白能与Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应,具有良好的免疫学活性。本文为进一步研究DHV-Ⅰ的复制机理奠定了基础。

环磷酰胺预处理制备兔抗Ⅰ型鸭肝炎病毒高免血清

以正常鸡胚尿囊液和环磷酰胺预处理试验兔， 再以Ⅰ型鸭肝炎病毒（Ｄｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ Ⅰ， ＤＨＶⅠ） 标准强毒（ＡＴＣＣ， Ｃ９／Ｄ２） 接种后致死鸡胚的尿囊液， 经灭活、乳化制成油佐剂抗原多次免疫试验兔， 获得了鸡胚中和效价（ＥＰＤ５０） 达１∶３２ 以上的兔抗Ⅰ型鸭肝炎病毒高免血清（ＤＨＶⅠＳ） 。

抗Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白单克隆抗体表位的鉴定

为了筛选Ⅰ型鸭肝炎病毒(Duck viral hepatitis typeⅠ,DVH-Ⅰ)VP1蛋白的抗原表位,试验应用噬菌体展示随机12肽库试剂盒,以抗DHV-ⅠVP1蛋白单克隆抗体纯化IgG作为靶标,通过ELISA和竞争抑制ELISA鉴定筛选克隆的结合特性,并对阳性克隆提取DNA进行测序分析。结果表明:通过3轮生物淘洗后,目标噬菌体得到282倍富集;随机挑选15个克隆进行测序分析及ELISA和竞争抑制ELISA检测,其中有8个噬菌体克隆可以与抗DVH-ⅠVP1蛋白单克隆抗体高度特异性结合,8个克隆的共有氨基酸序列为GMMIP。说明共有序列GMMIP可能是单克隆抗体2D5所识别的VP1蛋白的线性表位。

抗Ⅰ型鸭肝炎病毒单链抗体库的构建与筛选

为了构建和筛选抗Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)单链抗体库,试验用Ⅰ型鸭肝炎疫苗免疫樱桃谷鸭,以分离的外周血淋巴细胞总RNA为模板,根据抗体保守区序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增出鸭IgG轻链可变区和重链可变区基因,由Linker序列连接,用重叠延伸PCR(SOR-PCR)技术将其连接成单链抗体基因,将扩增的单链抗体基因导入pComb3XSS载体中构建抗DHV-Ⅰ噬菌体单链抗体库,并对该噬菌体单链抗体库进行3次吸附-洗脱-富集。结果表明:试验成功构建出库量为8.5×109pfu/mL的抗DHV-Ⅰ噬菌体单链抗体库,筛选出1株亲和力较高的抗DHV-Ⅰ噬菌体单链抗体。说明试验成功构建了鸭源抗DHV-Ⅰ噬菌体单链抗体库,筛选出1株与DHV-Ⅰ亲和力良好的鸭源噬菌体单链抗体。

珠江三角洲地区鸭肝炎病原分离及其致病性和理化特性测定

对珠江三角洲地区鸭肝炎发病雏鸭群进行病原分离、致病性试验及理化特性测定。结果共分离到 9株野毒 ,初步研究结果表明该 9株野毒具备Ⅰ型鸭肝炎病毒 (DHV Ⅰ )的基本特征 ,但其毒力具有不均一性。对 7日龄雏鸭的致病力 ,其中 3株LD50 分别为 10 -4 .36/0 .3mL、10 -4 .17/0 .3mL和 10 -4 .0 8/0 .3mL ;另外 3株LD50 分别为 10 -2 .4 8/0 .3mL、10 -2 .39/0 .3mL和 10 -2 .19/0 .3mL ;其余 3株对 7日龄雏鸭无致病性 ,但 2株对 1日龄的雏鸭却有一定的致病性 ,1株无致病性。该研究结果为分析本地区鸭肝炎疫情变化提供了依据。

NO及NOS在Ⅰ型鸭肝炎病毒致雏鸭肝损伤机制中的作用

人工感染4日龄雏鸭病毒性肝炎模型,探讨一氧化氮合酶(NOS)和NO在Ⅰ型鸭肝炎病毒感染后的肝脏中的动态变化及与肝损伤的关系。120羽4日龄雏鸭随机分为试验组和对照组,试验组腿部肌注Ⅰ型鸭肝炎病毒,对照组注射等量生理盐水。感染后动态观察肝脏的病变、测定肝组织内NOS活性和NO的浓度以及肝组织内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的分布规律。结果显示,病毒感染后,雏鸭肝功能和肝脏结构都受到不同程度的损害;NO对肝脏的损伤在感染后3d内持续增强,从4d开始逐渐减弱;iNOS主要存在于雏鸭的巨噬细胞中,其含量在感染早期上升,后期逐渐下降;肝组织内NOS活性及NO的浓度变化与免疫组化显示结果一致。结果表明,鸭肝炎病毒感染的雏鸭肝脏的损伤程度与NOS、NO浓度变化一致,提示NO在鸭肝炎病毒导致的雏鸭肝损伤中起重要作用。