NGF诱导PC12细胞早期分化的DIGE分析

目的筛选神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)处理后PC12细胞分化早期相关蛋白,寻找NGF药物作用靶点,为深入进行神经保护药物的研发提供理论依据。方法在建立NGF诱导PC12细胞分化模型的基础上,分别提取NGF处理前后的细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis,DIGE)系统获得蛋白点表达差异信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果NGF处理组有7个蛋白点发生变化;通过数据库检索,鉴定了3种结构和功能各异的蛋白。结论eEF-2、Rab GDIα和DPP与NGF诱导PC12细胞分化早期过程有关,可能是NGF的作用靶点。

2D-DIGE蛋白质组技术体系及其在植物研究中的应用

蛋白质组技术是植物基因功能鉴定和分析的强有力工具。经典的双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术,但差异蛋白质组分析使其具有更大的挑战性,因此在蛋白质水平的基因表达的定量分析研究需要更高灵敏度和更宽动力线性范围的技术。双向差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)是一种新出现的荧光标记的定量蛋白质组学技术,比经典的2-DE具有更高的动力学范围和灵敏性。该方法通过引入内标使得多个样品在一块胶上分离,进而减少了实验条件不一致引起的误差。2D-DIGE结合质谱、生物信息学及高可信度的统计分析使得成功地定量、鉴定植物蛋白质成为可能。本文综述了2D-DIGE蛋白质组学的基本原理,实验方法,2D-DIGE蛋白质组的优缺点和可能解决的方法,以及该技术体系在植物研究中的应用。

基于2D-DIGE/MALDI-TOF-MS技术筛选奶牛低血钙症生物标志物

奶牛乳热(MF)是一种严重的营养代谢性疾病,通常被分为临床型及亚临床型低血钙症(SH)。奶牛乳热的诊断通常是应用奶牛血浆中的钙浓度进行判定的,但是在奶牛乳热整个发生发展的过程中,发病的具体机制仍是研究的盲点。在本试验中通过筛选奶牛乳热、亚临床低血钙症及健康奶牛间生物标志物进而解释可能的发生机制。选取27头奶牛作为实验动物,并根据其血浆钙浓度及有无临床症状分为乳热组(MF组)、亚临床低血钙组(SH组)和正常组(C组)。在组内每3个样品混合成为1个混合样本应用于2D-DIGE试验。结果得到110个差异蛋白质点,选取其中80个点进行MALDI-TOF-MS质谱分析,得到66个阳性结果并整合成为16种蛋白质。根据试验结果,选取A2M、HP和PON1进行Western blotting验证试验。本试验首次证实A2M、HP和PON1是奶牛乳热症3种新的生物标志物,并分析了其在乳热症发生过程中的可能作用机制。

2D-DIGE-HPLC-nESIMS/MS对2,4-二硝基苯磺酸损伤HaCaT细胞差异蛋白质的鉴定

采用Cy2、Cy3和Cy5荧光染料标记蛋白,建立了人角质形成细胞HaCaT受2,4-二硝基苯磺酸(DNBS)刺激前后的双向胶内差异凝胶电泳(2D-DIGE)图谱,每组平行样本数为3。凝胶采用蛋白荧光染料Deep Purple进行后染色(Post-stain)。DeCyder定量分析软件在每块凝胶上平均检测到1 200个以上蛋白斑点,每块胶上都匹配得到的相同蛋白质斑点有846个。其中有7个斑点丰度变化在50%以上,统计学意义显著(P值小于0.05)。利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-nESI MS/MS)成功鉴定5个表达上调的斑点分别为X染色体开放阅读框26(Cxorf26)、人辅分子伴侣23(PTGES3)、钙调蛋白(CALM3)、肌球蛋白轻链6(MYL6)和断裂点丛集区蛋白1(BANF1);2个表达下调蛋白斑点被鉴定为转录延伸因子B肽链2(TCEB2)和核糖体蛋白L23(RPL23)。除MYL6被报道与皮肤疾病相关外,其它蛋白与皮肤病变的关系有待研究。该研究得到的7个差异表达蛋白为DNBS类化学致癌物职业接触者皮肤病变研究提供了有价值的线索。

2D-DIGE技术在蛋白质组学中的应用

双向荧光差异凝胶电泳(2D-D IGE)作为一种新型的蛋白质组分析技术,已经被广泛应用于动物、植物、微生物以及人类差异蛋白的研究。在动物医学方面,采用DIGE技术,通过对不同类型,不同个体的细胞、组织、或经过不同处理和不同生长条件下蛋白质表达差异分析,在研究疾病的分子机理、分子诊断、药物作用机理、毒理学等方面都有广泛的应用。在植物学方面,该技术可以用来分离和分析植物亚细胞结构蛋白质组以及在生物和非生物胁迫下,植物细胞中蛋白质表达的差异性,从而建立差异蛋白相互作用网络图,从而为研究伤害机制提供一定的依据。

梅花鹿致敏与休眠鹿茸干细胞差异蛋白表达的2D-DIGE分析

旨在对梅花鹿(Cervus nippon)致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞表达蛋白进行差异筛选、鉴定及生物信息分析,为深入探讨鹿茸独特的再生分子调节机制奠定基础。本研究采用双向荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2D-DIGE)分离蛋白样品;利用DeCyder 7.2分析软件对2D-DIGE图像进行统计学分析寻找差异表达蛋白;利用MALDI-TOF-MS(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry)鉴定差异蛋白,通过Mascot软件搜索NCBInr数据库寻找匹配的蛋白;采用PANTHER(Protein Analysis Through Evolutionary Relationships)软件对差异蛋白进行聚类分析,REACTOME数据库分析差异蛋白所参与的信号通路。结果得到了致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞2D-DIGE图谱,致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白丰度相比较,比值≥1.1倍以及比值≤-1.1倍(P<0.05)的差异蛋白点有159个,其中110个上调表达,49个下调表达,EDA(Extended data analysis)分析得到了多个Marker蛋白,质谱鉴定了84个差异蛋白质点,48个为阳性结果,共来自27种蛋白质。并对已鉴定蛋白进行了GO分析以及信号通路富集分析。致敏鹿茸干细胞与休眠鹿茸干细胞蛋白差异明显,质谱鉴定获得了来自多种可能与鹿茸再生相关的差异蛋白。由此可知,鹿茸再生是鹿茸干细胞从休眠到致敏的转化过程,需要多种蛋白分子以及信号通路的综合调控。

2D-DIGE技术对microRNA tsp-Novel-46调控的旋毛虫排泄分泌产物的研究

成熟的microRNA（miRNAs）是一类大小为22-24 nt的小RNA分子转录调节单元。过去10年中,研究人员发现了许多关于miRNAs生物起源和功能的基本机制。对寄生线虫miRNAs的研究（如旋毛虫和捻转血矛线虫）显示,特定的microRNA表达量变化与寄生虫特定生活阶段有关。

基于2D-DIGE技术对早期糖尿病肾病肾阴虚证型患者血浆蛋白质组学研究

目的:寻找糖尿病肾病肾阴虚证敏感的血浆分子标志物。方法:对12例早期糖尿病肾病肾阴虚患者的血浆和12例正常血浆进行荧光差异双向电泳(2D-DIGE)分析,选择表达差异大于1.5倍的蛋白斑点进行质谱分析。结果:成功建立糖尿病肾病肾阴虚证和正常血浆的胶内差异双向凝胶电泳图谱,通过分析共鉴定出11种差异蛋白质,包括结合珠蛋白、凝溶胶蛋白、载脂蛋白AI等。结论:荧光差异双向电泳能够客观显示糖尿病肾病肾阴虚证与正常血浆之间的蛋白质表达差异,本研究鉴定的11种蛋白有可能为糖尿病肾病的早期诊断和中医证型研究提供潜在的血浆分子标志物。

二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术在昆虫学研究中的应用

随着科学技术的迅猛发展,现代生物学技术已经发展到后基因组时代,蛋白质组学是在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科。二维差异凝胶电泳(Two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)技术是在双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)基础上发展起来的一种新兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术,是分析和鉴定基因功能的强有力工具,比经典的2-DE技术具有更高的动力学范围和灵敏性。该文就2D-DIGE技术的发展以及在昆虫研究上的应用前景进行了展望。

论吴简中的“关主记”

长沙走马楼吴简中记录了大量有关赋税缴纳的简。通过对“关主记”简尾的“省”字的探讨及将其与“关邸阁”作对比,发现二者的文书格式相类,“关”字语境相似,认为此处“关主记”之“关”义为“经过、通过”,并推测“主记”一职在吴简中也有一层监督职责。通过对“关+职官(+人名)”这类监督者角色的探讨,以窥探三国东吴时期的赋税交付制度。

2D-DIGE蛋白质组技术的探讨及其在微生物研究中的应用

目的:探讨双向差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)的实验方法,分析比较其优缺点,概述其在微生物研究中的应用。方法:以两株不同血清型的副溶血性弧菌为样本,通过2D-DIGE实验,得到两组蛋白质荧光染色分布图,与银染的效果比较。结果:直观的看到两株细菌的蛋白质差异,且可分析样品丰度变化。结论:该方法有一定的局限性,但却是研究蛋白质组丰度变化的强有力工具。

CRABP2 and FABP5 identified by 2D DIGE profiling are upregulated in human bladder cancer

Bladder cancer （BC） is the second most common malignancy of the human genitourinary tract,and is characterized by a high recurrence rate and expensive treatment） There is still no ideal biomarker for diagnosing or monitoring human BC.In the present study,we used proteomics analysis,including two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis （2D DIGE） and matrix-assisted laser desorption ionization time of flight/time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF/TOF MS）,to identify new potential protein markers of BC.

化湿行瘀清热方剂治疗口腔扁平苔藓前后血清中差异蛋白的初步研究

目的口腔扁平苔藓(oral lichen planus,OLP)是发生于口腔黏膜的常见病,目前尚无确切疗法。文中主要探讨化湿行瘀清热方剂对OLP的血清中差异蛋白变化情况。方法随机选取2013年10月至2015年5月间于河北医科大学第四医院口腔科确诊经化湿行瘀清热方剂治疗的30例OLP患者。抽取治疗前后空腹静脉血,离心获取血清并提取总蛋白。采用双向荧光差异凝胶电泳和液相色谱-质谱联用技术筛选、鉴定与OLP相关的差异蛋白,并通过蛋白免疫印迹法验证。结果化湿行瘀清热方剂治疗OLP前、后的血清中存在结合珠蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、补体成分C1和维生素D结合蛋白4种差异蛋白。治疗后,患者血清中的结合珠蛋白表达水平(159.704±24.228)较治疗前(103.086±27.536)升高,人抗凝血酶Ⅲ表达水平(98.00±28.04)较治疗前(150.00±54.04)降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论化湿行瘀清热方剂治疗OLP前、后血清中的结合珠蛋白、人抗凝血酶Ⅲ、补体成分C1和维生素D结合蛋白的表达存在差异,对OLP的发生、发展存在一定的影响作用。

胃癌及癌旁组织定量比较蛋白质组学研究

为寻找胃癌特异的肿瘤标记物,用于胃癌临床诊断及药物治疗靶点的选择,采用荧光差异显示凝胶电泳(DIGE)技术分离并筛选Cy3、Cy5及Cy2荧光素标记的胃癌及对应癌旁组织差异表达蛋白质,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)或串联质谱技术进行鉴定并分析。结果共筛选出33个差异表达蛋白质点,其中9个蛋白质点在胃癌组织中上调,24个蛋白质点下调。对22个蛋白质点采用质谱技术成功鉴定,突变结蛋白、锰超氧化物歧化酶、热休克蛋白60等在胃癌中高表达,热休克蛋白27、前列腺素F合酶、硒结合蛋白1、锌指蛋白160、微管蛋白α6、真核生物翻译延伸因子1α1等在胃癌组织中低表达,并筛选出5个未知蛋白。这些差异表达蛋白可望成为胃癌诊断的特异标记物,并与胃癌的发生、发展及预后等有关,为胃癌的诊断、发生机制的研究提供了新的思路。

高效氯氰菊酯对斑马鱼胚胎毒性的研究

高效氯氰菊酯是一种Ⅱ型拟除虫菊酯类农药,对鱼类及其它水生生物具有高毒,且在其它食物中也可检测到它的残留,高效氯氰菊酯的残留对人类的健康同样具有不容忽视的影响。为了解高效氯氰菊酯对鱼、对人类的毒性机制,选用0.05、0.1、0.2、0.6、1 mg/L五个梯度浓度的高效氯氰菊酯溶液,对斑马鱼胚胎进行毒性处理,在显微镜下观察其对斑马鱼发育形态变化和孵化率等影响。发现高效氯氰菊酯农药对斑马鱼胚胎有严重的致畸效应,这种致畸性呈现剂量依赖性。使用0.1 mol/L浓度的高效氯氰菊酯农药对斑马鱼胚胎进行处理,进行早期胚胎发育的毒性研究。采用荧光差异双向凝胶电泳(2-D DIGE)-质谱相结合的方法,鉴定出11个差异表达蛋白质。这些蛋白质与细胞骨架、应激反应和新陈代谢有关。这些研究结果为进一步研究高效氯氰菊酯对动物的毒性机制提供了基本信息。

同位素标记相对和绝对定量技术研究进展

定量蛋白质组学是蛋白质研究的前沿学科,目前常用的定量蛋白质组学研究技术有荧光差异凝胶电泳(DIGE)、同位素亲和标记(ICAT)等。同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。结合非凝胶串联质谱技术,该技术可对复杂样本、细胞器、细胞裂解液等样本进行相对和绝对定量研究,具有较好的定量效果、较高的重复性,并可对多达四种不同样本同时进行定量分析。对iTRAQ技术的原理、实验方法及应用进展进行了综述。

应用双向荧光差异凝胶电泳和质谱技术筛选口腔扁平苔藓唾液差异蛋白

目的:应用双向荧光差异凝胶电泳(2-D DIGE)和质谱技术筛选、鉴定与口腔扁平苔藓(OLP)患者唾液有关的差异蛋白。方法:收集3例OLP患者及3例健康人唾液,提取唾液总蛋白采用2-D DIGE技术分离蛋白质,寻找差异蛋白质点应用液相色谱一质谱联用技术(LC-MS)对差异蛋白质点进行质谱鉴定。结果:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示各样品条带清晰,无明显蛋白质丢失,经2-D DIGE分离蛋白质后,蛋白质点重复性较好。OLP患者组和健康对照组唾液差异蛋白质点数平均为(317±71)个,用质谱技术鉴定了重复性较好的4个差异蛋白质点(分泌型IgAl、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白)在OLP患者唾液中表达量均上调。结论:分泌型IgAl、锌α-2-糖蛋白、唾液淀粉酶、血清白蛋白在OLP患者唾液中高表达可能参与了OLP的发生、发展。

心肌缺血小型猪模型差异蛋白质组学研究

目的:筛选心肌缺血相关的蛋白质,以期发现心肌缺血特征性的差异蛋白质或蛋白质群。方法:对模型动物小型猪施行冠脉Ameroid环缩术,通过对模型动物的动态观察,综合评价,并参照WHO冠心病心绞痛诊断标准,明确术后28天符合心肌缺血诊断。术后28天,动物前腔静脉取血,血样处理后进行荧光差异蛋白电泳(2D-DIGE),对差异蛋白点进行MALDI-TOF/TOF分析,获取蛋白样品的肽质量指纹图。结果:共筛选出31个差异表达蛋白质点,其中17个蛋白质点在4周模型组中下调,14个蛋白点上调。对其中15个蛋白点采用质谱技术成功鉴定。白蛋白、血红素蛋白、烟酸受体在4周模型组中低表达,CH4 and secrete domain of Swine IgM、mutated immunoglobulin heavy chain、肌球蛋白、磷脂酶C、白细胞抗原相关酪蛋白磷酸酶相关蛋白、磷酸核糖焦磷酸相关蛋白-1、Ig gamma 4 chain constant region在4周模型组中高表达。结论:初步发现碱性磷酸酶、肌球蛋白、白细胞抗原相关酪蛋白磷酸酶相关蛋白、磷酸核糖焦磷酸合成酶相关蛋白1、血红素蛋白、烟酸受体可能与心肌缺血发生发展相关。

6-羟基多巴胺诱导PC12细胞帕金森模型中GRP78表达的研究

目的探讨神经毒素6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导PC12细胞的帕金森(PD)模型中GRP78的表达。方法在建立6-OHDA诱导PC12细胞帕金森模型的基础上,MTT法测细胞存活率和Hoechst33342染色检测细胞凋亡。分别提取6-OHDA处理组和对照组细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(Differentia Gel Electrophoresis,DIGE)技术获得蛋白点的差异表达信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果实验组细胞存活率为60%±4.8%,与对照组比较显著下降(P<0.05)。荧光染色可见细胞核呈固缩状或碎裂状的典型的凋亡形态学改变。DIGE分析发现6-OHDA组表达明显增高的一个蛋白质点,经质谱分析鉴定确认为GRP78。结论6-OHDA能够诱导PC12细胞凋亡,凋亡过程中GRP78表达增高,提示GRP78增高可能与PD的发病机制有关。

冠心病血小板功能蛋白与证侯相关性研究

目的研究冠心病血瘀证、非血瘀证与血小板功能蛋白相关性。方法纳入冠心病血瘀证组22例、冠心病非血瘀证组22例,采集血浆分离血小板,提取血小板蛋白,用荧光差异显示二维凝胶电泳筛选差异功能蛋白,基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱对血小板差异功能蛋白进行鉴定。对鉴定成功差异蛋白,Western-Blotting进一步验证。结果筛选,并质谱成功鉴定10个差异蛋白点。冠心病血瘀证组比对照组,血小板功能蛋白有2个:cDNA FLJ53327、cDNA FLJ43573fis表达增多;有8个:Isoform 2 of Integrin alpha-IIb、FGG50kDa protein、A26C1B ANKRD26-like、Actin-cyto-plasmic1、Actin-cytoplasmic 2、cDNA FLJ52842、Fibrinogen beta chain、Keratin type I表达减少。Fibrino-genβ成功验证。结论冠心病不同证侯与血小板功能蛋白表达水平明显相关,部分血小板功能蛋白可能是冠心病不同证侯的物质基础之一。