布鲁菌DK63＿426基因缺失株的构建及生物学特性研究

目的本研究构建了羊布鲁菌16M DK 63_426基因缺失株,分析其在细胞内的生存繁殖和致炎能力。方法以羊布鲁菌16M株基因组为模板,利用融合PCR技术将DK 63_426基因的上下游同源臂和卡那抗性基因融合,连接到克隆载体上,通过基因重组构建布鲁菌16M DK 63_426基因缺失株16MΔDK 63_426,观察布鲁菌亲本株16M和16MΔDK 63_426的生长变化趋势,建立侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,检测亲本株和缺失株16MΔDK 63_426在胞内的生存能力,检测IL-6、TNF-α细胞因子释放量。结果成功构建了16MΔDK 63_426;在体外相同培养条件下该缺失株与亲本株生长趋势相似,培养12 h即进入对数生长期,30 h进入平台期;16MΔDK 63_426在浸染RAW264.7细胞12 h胞内存活率极显著低于亲本株(P<0.01),在浸染8 h时IL-6的分泌量缺失株组均显著低于亲本株(P<0.05),TNF-α的分泌量缺失株组均显著高于亲本株(P<0.05),在侵染12 h时IL-6的分泌量缺失株组均极显著低于亲本株(P<0.01),TNF-α的分泌量缺失株组均极显著高于亲本株(P<0.01)。结论DK 63_426基因的缺失可影响布鲁菌的胞内存活,影响相关炎症因子的表达,为布鲁菌感染机制的研究奠定理论基础。