原发性骨质疏松症患者血清中sFRP4 DKK1表达及临床意义

目的:分析原发性骨质疏松症患者血清中sFRP4、DKK1表达及临床意义。方法:选取本院2019年1月至2021年1月期间收治的82例原发性骨质疏松症患者作为研究组,另选取同期健康体检者75例作为对照组,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清sFRP4、DKK1水平,采用电化学发光法检测血清β胶原降解产物(β-CTX)、Ⅰ型胶原氨基端延长肽(P1NP)、骨桥蛋白(OPN)以及N端骨钙素(N-MID)水平,使用骨密度仪检测股骨BMD值以及腰椎L_(1~4)BMD值。采用Pearson法分析血清sFRP4、DKK1水平与骨代谢指标以及骨密度之间的相关性;采用Logistics回归分析原发性骨质疏松症的影响因素;受试者工作特征曲线(ROC)分析血清sFRP4、DKK1水平对原发性骨质疏松症的诊断价值。结果:研究组血清sFRP4(62.98±10.79)μg/L和DKK1(14.28±3.97)μg/mL表达水平显著高于对照组(46.87±8.88)μg/L和(11.43±3.04)μg/mL(P<0.05),研究组β-CTX(4.52±1.02)ng/mL、P1NP(47.28±4.26)ng/mL、OPN(26.64±5.11)ng/mL以及N-MID(89.87±8.02)ng/mL显著高于对照组(3.55±0.92)ng/mL、(30.84±4.53)ng/mL、(19.01±4.12)ng/mL和(81.95±9.50)ng/mL(P<0.05),研究组股骨BMD(0.58±0.16)g/cm^(3)和腰椎L_(1~4)BMD(0.64±0.18g/cm^(3))显著低于对照组(0.82±0.19)g/cm^(3)和(0.83±0.23)g/cm^(3)(P<0.05)。根据pearson相关性分析得知,sFRP4和DKK1的表达水平呈正相关性(P<0.05),sFRP4和DKK1表达水平与股骨BMD和腰椎L_(1~4)BMD呈负相关(P<0.05),与β-CTX、P1NP、OPN和N-MID呈正相关(P<0.05)。根据Logistic回归分析得知,sFRP4、DKK1高表达是影响原发性骨质疏松症发生的危险因素(P<0.05)。血清sFRP4诊断原发性骨质疏松症的AUC为0.874,DKK1诊断原发性骨质疏松症的AUC为0.809,二者联合诊断原发性骨质疏松症的AUC为0.921,优于血清sFRP4和DKK1各自单独诊断(Z联合vs sFRP4=2.851、Z联合vsDKK1=4.365,P均<0.05)。结论:血清sFRP4和DKK1在原发性骨质疏松症患者中显著升高,与患者的骨代谢和BMD密切相关,二者联合可更好的诊断原发性骨质疏松症。

DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯及其预后的相关性研究

目的探讨DKK1蛋白表达与肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯及其预后的相关性。方法选择2005年1月—2012年12月来我院行切除治疗肝内胆管癌患者78例,制作肝内胆管细胞癌组织及癌旁组织的组织芯片,并于术前进行生化指标测定。患者术后每隔3个月复查1次,并结合患者的临床资料和病历资料,采用Kaplan-Meier法进行无复发生存曲线及总生存曲线的绘制,采用Cox比例风险回归模型进行多因素分析,确定影响预后无复发生存时间(Relapse-free survival,RFS)和总生存时间(Overall survival,OS)的因素。结果 DKK1蛋白表达阴性与表达阳性的患者间GGT、肝门淋巴结侵犯、Child-Pugh分级、MMP9差异存在统计学意义(P<0.05)。78例肝内胆管细胞癌患者组织芯片结果发现DKK1蛋白在肝内胆管细胞癌的阳性表达率为35.90%(28/78),在癌旁组织中的阳性表达率为14.10%(11/78)。78例肝内胆管细胞癌患者的1、3、5年的总生存率和无复发生存率分别为51.28%(40/78)与50.00%(38/78)、41.03%(32/78)与38.46%(30/78)、25.64%(20/78)与23.08%(18/78)。相关危险性因素经单因素、多因素分析后,研究结果显示GGT、CA19-9、CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者RFS的预后因素;CEA、肿瘤大小、DKK1、肝门淋巴结侵犯是影响肝内胆管细胞癌患者DFS的预后因素。DKK1蛋白表达阳性与阴性的OS与RFS曲线显示,5年后肝内胆管细胞癌患者DKK1蛋白表达阳性与阴性的总生存率分别为28.20%与20.51%;无复发生存率分别为24.36%与21.79%。结论肝内胆管细胞癌患者淋巴结侵犯与否与DKK1蛋白表达密切相关,DKK1蛋白表达可能是影响肝内胆管细胞癌患者OS和RFS的预后因素。

miR-92a/Dickkopf相关蛋白1介导丁酸钠调控Wnt/β-catenin信号通路抑制结肠癌细胞增殖

近年来已有研究表明,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACs)丁酸钠可以抑制结肠癌细胞增殖,促进结肠癌细胞凋亡,但其分子调控机制仍有待于深入研究。在本研究中,CCK-8检测、5-乙炔基-2-脱氧尿嘧啶核苷(Edu)增殖实验和流式细胞术分析证实,丁酸钠处理结肠癌细胞24 h后结肠癌细胞增殖能力明显减弱,凋亡率明显增加(P<0.01)。进一步转录物组测序结果表明,丁酸钠处理结肠癌细胞后,Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂Dickkopf相关蛋白1(DKK1)水平的表达显著高于未处理组(P<0.01);荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western印迹分析进一步验证,丁酸钠可以显著诱导DKK 1的表达水平,同时抑制Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因c-Myc的表达水平(P<0.01)。沉默结肠癌细胞的DKK 1后进一步使用丁酸钠进行处理,Edu增殖实验和流式细胞术结果显示,抑制结肠癌细胞中DKK 1后可以逆转丁酸钠对结肠癌细胞的作用(P<0.01)。生物信息学预测数据库分析显示,DKK 1可能与miR-92靶向结合;qRT-PCR结果显示,丁酸钠可以明显降低结肠癌细胞中miR-92a的表达(P<0.01);Western印迹技术和双萤光素酶报告基因检测证实,miR-92a与DKK 1 mRNA的3′-UTR存在靶向结合关系(P<0.01)。过表达结肠癌细胞中的miR-92a后进一步使用丁酸钠进行处理也能逆转丁酸钠对结肠癌细胞的作用(P<0.01)。总之本研究明确了,丁酸钠可以通过miR-92a/DKK1调控Wnt/β-catenin信号通路进而抑制结肠癌细胞增殖,促进结肠癌细胞凋亡。

人Dickkopf1基因腺病毒载体的构建及感染黑色素瘤后β-catenin表达的研究

目的构建高表达外源性Dickkopf1(DKK1)基因的重组腺病毒载体(Ad-DKK1);感染黑色素瘤细胞株后研究Wnt信号通路中主要信号分子β-catenin的表达变化。方法利用PCR技术扩增目的基因DKK1;应用分子克隆技术和AdEasy系统重组腺病毒技术,把目的基因亚克隆到穿梭质粒;经酶切和测序后,在BJAdeasy中同源重组;用PacⅠ酶切过的重组腺病毒DNA在HEK293中包装并扩增;实验分为5组:Ad-DKK1感染组、Ad-SimDKK1感染组、Ad-GFP感染组、Ad-RFP感染组和空白细胞对照组。按照MOI值为80感染恶性黑色素瘤细胞株A375,观察细胞形态;RT-PCR法检测DKK1、β-catenin基因的表达,MTT法检测细胞活力。结果重组腺病毒Ad-DKK1经酶切鉴定与测序证实构建成功。感染A375细胞,感染率均大于80%,感染后细胞形态无明显改变。Ad-DKK1感染组DKK1的表达水平(1.638±0.067)与其他4组(0.718±0.086、1.424±0.125、1.414±0.089、1.423±0.088)比较差异具有统计学意义(P<0.05),其β-catenin的表达水平(0.590±0.011)与其他4组(0.895±0.012,0.749±0.024,0.754±0.012,0.759±0.014)比较差异具有显著统计学意义(P<0.01)。MTT法检测细胞活力:Ad-DKK1感染组(0.370±0.014)与其他4组(0.412±0.017、0.398±0.006、0.395±0.007、0.426±0.016)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建重组腺病毒Ad-DKK1,经其感染的恶性黑色素瘤细胞中DKK1的表达明显增强,β-catenin的表达显著降低,A375的细胞活力受到抑制。

益骨汤含药血清通过经典Wnt信号通路促进成骨细胞增殖分化的研究

目的:在经典wnt信号通路抑制剂大鼠Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的干预下,观察益骨汤含药血清对成骨细胞的经典Wnt信号通路的影响,探究益骨汤治疗骨质疏松的作用机制,为临床使用补肾活血中药防治骨质疏松症提供实验依据。方法:将40只雌性SD大鼠随机分成2组,益骨汤水提液组和空白对照组,连续灌胃10天,获取含药血清。从乳鼠颅盖骨中分离培养成骨细胞,实验分为4组,即A组(益骨汤含药血清组)、B组(DKK1组)、C组(DKK1+益骨汤含药血清组)、D组(空白血清对照组)。进行细胞增殖MTT检测、碱性磷酸酶活性检测,RT-PCR检测经典Wnt/β-catenin通路中β-链蛋白(β-catenin)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP-5)、DKK1基因的表达情况。结果:根据MTT法动态观察各组成骨细胞增殖,发现成骨细胞增殖呈规律性:48 h至72 h成骨细胞呈对数增长期,96 h后细胞增殖逐渐受到抑制。同一时间点与B组比较,A、C、D各组成骨细胞的增殖和ALP活性显著较高,差异均有统计学意义(P<0.05)。同一时间点与D组比较,A组成骨细胞的增殖和ALP活性显著较高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与B组比较,A、C、D组β-catenin mRNA、LRP-5 mRNA、TCF mRNA的表达均明显升高,DKK1 mRNA的表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与D组比较,A组β-catenin mRNA、LRP-5 mRNA、TCF mRNA的表达均明显升高,DKK1 mRNA的表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:益骨汤含药血清可能是通过抑制DKK1的高表达,从而上调经典Wnt/β-catenin信号中β-catenin、LRP-5、TCF基因的表达,达到促进成骨细胞增殖,起到抗骨质疏松作用。

类风湿性关节炎患者外周血T细胞RANKL增加且血清Dickkopf1降低

目的探讨骨代谢相关分子在类风湿性关节炎(RA)患者骨代谢异常和疾病进展过程中的作用。方法纳入RA患者66例及健康对照20例,搜集相关临床信息。利用电化学发光免疫分析法检测受试者血清中骨钙素N端中段(OC-N-MID)和1型胶原蛋白交联羧基末端肽(CTX)水平。采用液相悬浮芯片法检测Wnt抑制因子Dickkopf1(DKK1)、核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)含量。利用流式细胞术检测外周血T细胞上RANKL的水平。结果与健康对照组相比,RA患者血清中OC-N-MID、CTX含量无显著性差异,RANKL水平升高,DKK1水平降低。RA患者外周血T细胞上RANKL水平增加,尤其CD3+T细胞亚群上RANKL增加显著。结论 RA患者T细胞上RANKL水平增加,血清中RANKL含量升高,DKK1水平降低。

Wnt/β-catenin信号通路在双酚A暴露对子鼠雄性生殖细胞表达

目的探讨Wnt/β-catenin信号通路蛋白在出生前后双酚A(BPA)暴露对子鼠雄性生殖表达。方法 ICR孕鼠饮水染毒,自受孕0天随机分为:溶剂对照组、100 nmol/LBPA组、300 nmol/LBPA组;雄性仔鼠出生后6周处死,取睾丸组织,免疫组化检测β-catenin、DKK1蛋白的表达。结果免疫组化结果显示,与溶剂对照组比较,BPA暴露组β-catenin、DKK1蛋白表达明显增加,多分布在精原细胞和睾丸间质细胞中,且间质细胞强阳性。结论 Wnt/β-catenin信号通路蛋白可能参与了BPA暴露对子鼠雄性生殖细胞表达影响。

人源Dickkopf1原核表达产物对体外培养的黑素细胞的抑制作用

目的:观察人源Dickkopf1原核表达产物(DKK1蛋白)对体外培养的黑素细胞的抑制作用。方法:采用MTT法测定细胞增殖情况;光学显微镜观察细胞形态学变化;氢氧化钠裂解法测定黑素合成;多巴氧化法测定酪氨酸酶活性。结果:DKK1蛋白对黑素细胞的增殖有抑制作用,能使细胞数明显减少(P<0.05);光学显微镜观察到DKK1蛋白作用的黑素细胞胞体较大,形态略呈多角形,树突较粗短;并能使黑素合成显著下降(P<0.05);使酪氨酸酶活性显著减弱(P<0.05)。结论:DKK1蛋白能抑制黑素细胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性,为DKK1蛋白应用于治疗色素增多性疾病奠定实验基础。

非小细胞肺癌患者血清DKK1蛋白表达及其与骨转移的关系

目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）患者血清中Wnt通路抑制因子DKK1蛋白的表达水平及其与骨转移的关系.方法 应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测33例有骨转移、41例无骨转移NSCLC患者及32名健康体检者血清中DKK1蛋白的表达水平采用方差分析和独立样本t检验比较其差异.DKK1表达和骨转移之间相关性的分析采用Pearson相关分析法.结果 NSCLC患者血清中DKK1蛋白表达水平为（79.6±8.3）ng/ml,高于健康体检者的（21.5±6.4）ng/ml,两者差异有统计学意义（t=13.17,P=0.001）.NSCLC患者中有骨转移组DKK1蛋白表达水平为（110.3±11.4）ng/ml,高于无骨转移组的（60.7±10.5）ng/ml,两组差异有统计学意义（t=14.128,P=0.003）.血清DKK1水平与NSCLC骨转移之间呈正相关（r=0.855,P〈0.001）.结论 NSCLC患者血清中DKK1蛋白的表达水平与骨转移关系密切.DKK1有望成为预测NSCLC有无骨转移的生物学指标.

DKK1蛋白在兔下颌骨牵引成骨过程的表达及其意义

目的探讨下颌骨牵引成骨(MDO)过程Wnt/β-catenin信号通路拮抗剂DKK1蛋白的表达及意义。方法将健康成年新西兰大白兔24只分为牵引组和对照组,每组12只。牵引组行双侧下颌骨截骨后放置牵引器。对照组行双侧下颌骨截骨后直接牵开5mm,钛板钛钉固定。细胞图像分析仪测量骨痂DKK1的表达。结果免疫组织化学染色显示,DKK1主要定位于骨痂组织的成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞胞质中。牵引组随着牵引启动DKK1表达逐渐增加,在术后第10天时达高峰,随着牵引张力消失,术后17~24d表达减弱,术后31~38d,骨细胞内DKK1表达逐渐降低,胞核、胞质染色均为阳性。在各时间点,牵引组DKK1表达均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论牵引成骨过程中,随着牵引应力激活Wnt/β-catenin信号通路,通路相关蛋白表达增强,其负性调控因子DKK1表达也随之增强,有利于牵引区新骨生成和改建重塑。

rAd-DKK1-shRNA表达载体的构建

目的 筛选构建针对骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC）的小干扰RNA（shRNA）腺病毒载体.方法 根据shRNA靶位点的选择原则,从TRCshRNA数据库及Ambion shRNA数据库中择优选取3条DKK1 shRNA序列,通过DKK1构建过表达载体,筛选出最佳干扰序列,体外同源重组构建DKK1-shRNA腺病毒表达载体,经酶切、PCR鉴定、测序.结果 成功构建pYr-1.1-DKK1-shRNA-153、pYr-1.1-DKK 1-shRNA-155、pYr-1.1-DKK1-shRNA-Am表达载体,分别通过RT-PCR与Western印迹检测DKK1的表达,结果显示pYr-1.1-DKK 1-shRNA-153为最佳干扰序列.结论 成功构建了针对BMSC的小干扰RNA（shRNA）腺病毒载体,为后续靶向目的基因的实验研究提供了依据.