响应面分析法优化固定化细胞转化DL-ATC生产L-半胱氨酸工艺条件

利用SAS软件的Plackett-Burman试验设计法及响应面分析法,对海藻酸钙固定化假单胞菌(Pseudomonas sp.)HY1040转化DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)生产L-半胱氨酸的工艺条件进行了优化,得到较佳的转化工艺条件:固定化细胞接种量为25.5 mL,DL-ATC质量浓度为1.0%,固定化细胞增殖时间为12.9 h.经5批次转化试验考察,固定化细胞比酶活力平均达934u/mL,较优化前提高38.9%.经连续转化4批次,底物转化率仍可保持在初始值的91.0%以上.

假单胞菌酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸

采用微生物酶转化法制备L-半胱氨酸具有周期短、成本低、区域和立体选择性强、反应条件容易控制、环境友好等特点,与传统的毛发水解以及化学合成工艺相比显示出明显的优越性。本文从假单胞菌产酶条件和酶学性质、DL-ATC生物转化途径、固定化细胞转化工艺、基因工程菌的研究、以及L-半胱氨酸脱巯基酶的研究等5个方面介绍了国内外关于生物转化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)合成L-半胱氨酸的研究进展。

微生物转化DL-ATC生产L-半胱氨酸菌种筛选及产酶条件研究

以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid,DL-ATC)作为分离平板中的唯一氮源,从土样中筛选可将DL-ATC生物转化为L-半胱氨酸的微生物菌株,得到5株转化菌株GJx5、GJx7、TJ4、TJ6和TJ7,其中GJx7菌株的转化能力较高。当DL-ATC浓度为1%时,经微生物转化2 h,反应液中L-半胱氨酸含量可达68.3μg/ml。该菌株传代性能稳定,连续传8代后相对转化活力为95.4%。以GJx7菌株为试验菌株的产酶条件试验表明,较适培养基初始pH值为7.0,摇瓶装量为250 ml锥形瓶装50 ml培养基,产酶较佳的碳源和氮源分别为麦芽糖和酵母膏。在较佳产酶条件下,当DL-ATC浓度为1%时,转化液中L-半胱氨酸含量可达320.2μg/ml,较优化前提高4.7倍。

酶法转化DL-ATC生产L-半胱氨酸

目的介绍酶法转化DL-ATC生产L-半胱氨酸的微生物代谢途径、生物转化反应涉及的酶的种类及特性,以及酶法转化生产工艺。方法分析国内外有关文献资料,综述L-半胱氨酸的用途及国内外研究现状。结果与结论酶法转化DL-ATC生产L-半胱氨酸工艺为环境友好的绿色合成工艺。固定化细胞转化技术和基因工程的发展使酶法转化DL-ATC生产L-半胱氨酸工艺具有很好的应用开发前景。

恶臭假单胞菌TS1138透性化细胞的制备及其转化DL-ATC生成L-半胱氨酸的特性研究

探讨了恶臭假单胞菌TS1138菌体透性化细胞的制备工艺,并对所得透性化细胞转化DL-ATC生成L-半胱氨酸的反应特性进行了研究.结果表明,以2%的甲苯为渗透剂,在25℃条件下对浓度为20%的菌悬液渗透处理30 min,所得透性化细胞的酶活达1 475 U/g,为未渗透细胞的10倍.该透性化细胞的最适转化反应温度为35℃,最适反应pH为8.0,在pH 7.5～9.0范围内稳定,Cu2+、Ag+和Zn2+对透性化细胞的转化反应具有较强抑制作用,Cu2+的抑制作用最强.

DL-ATC对TS1138菌株酶法生产L-半胱氨酸的影响

以假单胞菌(Pseudomonas sp.)TS1138菌株为供试菌株,研究了在转化DL-ATC生产L-半胱氨酸过程中,DL-ATC对产酶和转化的影响.结果表明:DL-ATC对TS1138菌株产酶具有诱导作用,产酶培养中必须适量添加.从L-半胱氨酸的产量和DL-ATC转化率两个方面综合考虑,酶法生产L-半胱氨酸的最适DL-ATC为9 g.L-1,采用间歇流加DL-ATC方式可使L-半胱氨酸的产量提高56.25%.

微生物酶法转化生产L-半胱氨酸的工艺研究

L-半胱氨酸（Cys）侧链巯基是构成蛋白质活性基团的重要氨基酸，在生物化学、医药、食品、饲料、化妆品等行业具有广泛的用途，国内外的需求量逐年增长。然而，Cys难以通过单纯的微生物发酵来进行生产；由于化学合成的步骤繁多，也很难进行化学合成。传统生产方法沿用毛发酸解制取L-半胱氨酸，收率低，能耗高，水解过程产生难闻气体及大量废酸，环境污染严重。

恶臭假单胞菌TS1138转化生产L-胱氨酸的工艺研究

对以DL-2-氨基-△^2-噻唑啉-4-羧酸（DL-2-amino-A2thiazoline-4-carboxylic acid，DL—ATC）为底物原料，经微生物酶法催化合成L-半胱氨酸，并进一步氧化和分离纯化产物L-胱氨酸的生产工艺和条件进行了研究。建立了以恶臭假单胞菌TS1138（Pseudomonas putida TS1138）全细胞为酶源，反复多次催化底物合成L-半胱氨酸，并以2．0％二甲基亚砜（DMSO）为氧化剂氧化生成L-胱氨酸，进而通过001×7型阳离子交换树脂纯化胱氨酸的新工艺。采用高效液相色谱法考察该方法L-胱氨酸的总收率可以达到78．55％，纯度为99．12％。该方法简单高效，解决了酶稳定性差不能重复使用，而固定化酶方法繁琐成本高的问题，为我国L-半胱氨酸和L-胱氨酸的生产开辟一条新途径。

微生物转化法合成L-半胱氨酸的研究

以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)为转化底物,采用来自假单胞菌(Pseudomonas sp.)TS1138的L-半胱氨酸合成酶系对DL-ATC进行生物转化合成L-半胱氨酸.对转化条件进行了研究,得出TS1138菌株合成L-半胱氨酸的最适转化条件;反应温度为42～44℃,转化时间为2.5 h,底物质量浓度为6g/L,酶源细胞浓缩倍数为5倍.动力学研究表明,TS1138菌株L-半胱氨酸合成酶系的米氏常数(Km)为7.1 997 mmol/L,最大初反应速度Vmax=41.6629 mmol/(L·min).

酶催化合成L-半胱氨酸产酶培养基及产酶条件的研究

假单胞菌(Pseudomonas sp.)TS1138经DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)的诱导,在菌体内能产生催化该诱导物生成L-半胱氨酸的酶系.对产酶培养基及产酶条件进行了研究,得出DL-ATC的最适添加量为0.5%,最适碳源为葡萄糖,最适氮源为尿素,最适培养温度为27～29℃,最适摇瓶装液量为40mL.根据摇瓶优化结果,进行了7 L罐试验,酶活力最高达1 780 U/mL.

Pseudomonas sp.F-12发酵优化及转化合成半胱氨酸的研究

通过不同发酵策略对Pseudomonas sp.F-12以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)为底物生产L-半胱氨酸的过程进行优化,以分批发酵和指数流加发酵的形式进行生产,将发酵过程中的DL-ATC浓度分别控制在5 g/L和15 g/L。结果表明15 g/L DL-ATC分批发酵生产L-半胱氨酸得到最高酶活为149.1 U/mL,比活为70.9 U/mg DCW;采用15 g/L DL-ATC两阶段指数流加发酵,可使最高酶活达到313.3 U/mL,提高为分批发酵的2.1倍。同时在两阶段发酵过程中,能减少DL-ATC用量为5 g/L。两阶段发酵过程采用不同流加策略,证明菌体得率对酶活水平有显著影响。首次考察了Pseudomonas sp.F-12全静息细胞转化合成L-半胱氨酸的主要影响因素。结果表明Pseudomonas sp.F-12的最适转化pH为8.0,最适转化温度为30℃。加入甲苯等有机溶剂改变细胞膜通透性,使得半胱氨酸产量比对照组提高7.16倍,最高摩尔转化率达到93.3%。不同金属离子对转化影响不同,0.1 mmol/L Fe2+对转化反应有促进作用,0.1 mmol/L Co2+、Zn2+、Ni2+等重金属离子有抑制作用。研究结果为微生物法发酵及全细胞转化合成半胱氨酸的后续工业化奠定了基础。

海藻酸钠/明胶协同固定化假单胞菌B-3酶法合成L-半胱氨酸

目的:研究海藻酸钠/明胶协同固定化假单胞菌B-3的制备条件,以及固定化细胞酶法转化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)生物合成L-半胱氨酸的工艺条件。方法:比较8种不同的细胞固定化方法,优选海藻酸钠/明胶协同固定化为假单胞菌B-3最佳的固定化方法,并对凝胶组成,增殖活化时间和菌体包埋量等条件进行优化;通过向转化液中添加表面活性剂Tween-60,N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(L-NCC水解酶)激活剂Mn2+和L-半胱氨酸脱巯基酶抑制剂盐酸羟胺来提高L-半胱氨酸产量。结果:以增殖活化10h的固定化细胞为酶源,DL-ATC·3H2O质量浓度为20g/L,pH8.0,42℃酶促反应10h,产物L-半胱氨酸含量达9.18g/L,较游离细胞提高了29.0%,底物转化率达75.83%。固定化细胞重复使用4批次后相对转化率仍能维持在初始值的71.5%。结论:海藻酸钠/明胶协同包埋假单胞菌B-3细胞具有良好的生物转化活性;转化液中添加适量的Tween-60、Mn2+和盐酸羟胺能明显提高L-半胱氨酸产量。