反义DLC-1基因对结直肠癌LoVo细胞增殖和细胞周期的影响

目的应用核糖核酸干扰(RNAi)技术,通过对大肠癌细胞株LoVo中DLC-1基因mRNA表达的抑制,初步探讨DLC-1基因对大肠癌细胞株的生物学行为影响。方法构建DCL-1的RNAi重组体pGCsiDLC,转染大肠癌LoVo细胞株。采用RT-PCR观察转染前后细胞株中DLC-1 mRNA以及Bax、Bcl-2基因表达的改变,MTT比色法检测转染前后细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建发卡siRNA真核表达载体pGCsiDLC;pGCsiDLC转染LoVo细胞后,电泳显示DLC-1 mRNA表达水平明显下降;LoVo细胞生长曲线增长幅度亦随时间的增加而逐渐增高,在48h最为明显,RNAi组细胞比脂质体组及空白对照组细胞增殖明显增高(P<0.05);干扰后的LoVo细胞株G0/G1期发生阻滞,而G2/M期细胞数量分布减少。而Bax和bcl-2基因表达在干扰前后未见明显改变。结论成功构建载体介导的DLC-1靶向RNAi重组体可有效抑制LoVo细胞DLC-1 mRNA表达;DLC-1基因可抑制结直肠癌细胞增殖并且对细胞周期重新分布,其可能与结直肠癌的发生发展有一定关系,可能是一个新的抑癌基因。

3种结肠癌细胞株中DLC-1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究

目的:研究候选抑癌基因DLC-1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨结肠癌细胞株DLC-1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性。方法:采用RT-PCR技术分别检测DLC-1基因在人结肠癌细胞株CaCo-2、HT-29和LoVo中的表达水平;应用甲基化特异性PCR(MSP)方法和亚硫酸氢盐修饰DNA测序检测启动子区域甲基化状态;分别用0、5、10μmol.L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理DLC-1基因启动子区域高甲基化状态细胞后,再检测DLC-1基因mRNA表达水平。结果:人结肠癌细胞株CaCo-2和LoVo中DLC-1 mRNA呈阳性表达,HT-29中的表达呈阴性表达;CaCo-2和LoVo细胞DLC-1基因启动子区域未发生甲基化,而HT-29出现启动子区高甲基化状态;经5氮杂胞苷药物干预后,HT-29结肠癌细胞的DLC-1基因表达明显增强。结论:结肠癌细胞株HT-29中DLC-1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关。

5-氮杂-2-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对人胃癌SNU-1细胞系中DLC-1基因启动子甲基化及mRNA表达的影响

目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycitydine,5-Aza-d C)联合曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)对胃癌细胞株SNU-1中DLC-1基因的甲基化水平和mRNA表达的影响。方法应用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)和实时荧光定量PCR,检测5-Aza-d C单药或联合TSA作用于SNU-1细胞后,DLC-1基因的甲基化水平及DLC-1基因mRNA表达量。结果对照组中DLC-1基因呈甲基化状态;5-Aza-d C药物干预组DLC-1基因出现明显的非甲基化条带,甲基化条带亮度减弱;TSA组条带无明显变化;5-Aza-d C+TSA组DLC-1基因甲基化条带明显减弱,且出现非甲基化条带。5-Aza-d C组DLC-1 mRNA表达量是对照组的2.22倍,TSA组DLC-1 mRNA表达量是对照组的2.20倍,5-Aza-d C+TSA组DLC-1 mRNA表达量是对照组的4.50倍(P<0.05)。结论5-Aza-d C能诱导胃癌细胞系SNU-1中DLC-1基因去甲基化,与TSA联用可提高DLC-1 mRNA表达。

早期肺癌患者DLC-1基因表达与临床特征研究

目的探讨DLC-1基因在早期肺癌组织中的表达及与肺癌患者临床特征的关系。方法对60例肺癌组织标本及癌旁组织进行DLC-1基因扩增检测,同时检测9例良性病变组织中DLC-1基因的表达状况,结合患者的临床特征分析DLC-1基因的表达状况与其的关系。结果 60例肺癌标本中,有22例表达阳性,癌旁组织有49例表达阳性,二者差异有统计学意义(P<0.01)。9例良性病变组织中,有7例DLC-1基因mRNA表达阳性,与肺癌组有显著差异(P<0.05)。结论 DLC-1基因在早期肺癌组织中表达缺失或者低表达,并与肺癌患者较差的临床预后明显相关。

DLC-1基因在晚期肺癌组织中的表达及与预后的相关性

目的探讨DLC-1基因在晚期肺癌组织中的表达水平及与肺癌患者预后的关联。方法对72例肺癌组织标本及癌旁组织进行DLC-1基因扩增检测,然后对患者随访1年。根据不同组别患者复发转移和生存情况,分析DLC-1基因的表达状况与预后的相关性。结果 72例肺癌标本组织中有9例的DCL-1基因表达阳性（12.5%）,与之相对应的癌旁组织中有50例DCL-1基因表达阳性（66.7%）,两者之间的差异有统计学意义（χ~2=48.27,P〈0.001）。对72例肺癌患者随访1年后发现：DLC-1基因的表达状况与患者的组织学、组织分化、复发或转移相关（χ~2=18.67,P〈0.001）,与患者的1年生存相关（χ~2=6.81,P〈0.01）。结论 DLC-1基因在肺癌组织中表达缺失或者低表达,并与肺癌患者较差的临床预后相关。

DLC-1基因表达缺失在胰腺癌发展过程中的机制研究

目的探讨DLC-1基因在胰腺癌的发展过程中的作用。方法通过表达谱基因芯片分析和qPCR检测DLC-1基因在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达差异,并检测不同胰腺癌细胞株中该基因的表达水平;同时过表达DLC-1基因的慢病毒感染胰腺癌细胞系SW1990,通过流式细胞术和Transwell实验观察DLC-1基因对胰腺癌细胞株的增殖及侵袭能力的影响。结果 DLC-1基因在胰腺癌组织中的表达显著低于癌旁组织;过表达DLC-1基因能够抑制胰腺癌细胞系SW1990的增殖和侵袭能力。结论 DLC-1基因的过表达对胰腺癌的发展有着明显的抑制作用。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷联合古曲霉素A对人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226细胞增殖、凋亡及DLC-1基因表达的影响(英文)

本研究旨在探讨DNA甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-cdR)联合组蛋白去乙酰化抑制剂古曲霉素A(TSA)对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226细胞的生物学活性及DLC-1基因表达调控的影响。5-Aza-CdR及TSA单独或联合作用于RPMI 8226细胞系,用CCK-8法检测细胞增殖活性,实时定量PCR(RT-PCR)检测药物作用后DLC-1基因表达情况,ELISA检测药物作用后RhoA及Rac1蛋白表达水平。结果表明,5-Aza-CdR及TSA对多发性骨髓瘤细胞具有明显生长抑制作用并呈剂量依赖性(P<O.05);与5-Aza-CdR及TSA单药组比较,联合用药组对细胞的抑制作用更强,细胞凋亡率明显升高(P<0.05);对照组RPMI 8226细胞DLC-1基因微弱表达,5-AzacdR组DLC-1基因表达增强,且呈剂量依赖性重新表达(P<0.05),TSA虽不能诱导基因重新表达,但两药联合应用时可明显增强细胞DLC-1基因的表达;实验组与对照组多发性骨髓瘤细胞相比,rhoA及Rac1蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论:5-Aza-CdR及TSA能有效的逆转RPMI 8226细胞DLC-1基因的表达,并明显增强对多发性骨髓瘤细胞的生长抑制及促凋亡作用。这种抑制作用可能与其抑制Rho/ROCK信号途径有关。

DLC-1基因启动子甲基化对于B-ALL的预后价值

目的观察儿童急性淋巴细胞白血病中肝癌缺失-1(DLC-1)抑癌基因启动子甲基化状态,评估该基因甲基化对于急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)的预后价值。方法对40例B-ALL患儿DLC-1启动子甲基化状态与白血病敏感预后指标白血病微小残留病灶(MRD),以及其他对B-ALL预后可能有影响的指标作一比较,评价DLC-1对于B-ALL的预后判断价值,以及是否可以作为B-ALL的独立预后危险因素。结果 DLC-1甲基化阳性的B-ALL患儿的复发率和5年无事件生存率均与DLC-1甲基化阴性患儿差异有统计学意义(P<0.05)。DLC-1启动子甲基化与MRD的结果分布并不一致(P>0.05)。但两者同为阳性结果的5例患儿在5年内全都复发,复发率为100%;而两者同为阴性结果的11例患儿,仅1例在5年内复发,复发率为9%。多因素分析显示仅MRD可作为独立的预后危险因素(P=0.017),DLC-1基因甲基化阳性患儿复发风险是甲基化阴性患儿的8.5倍。结论 DLC-1甲基化和MRD都是B-ALL有意义的预后指标,两者结合可为临床提供覆盖面更广的预后信息。DLC-1甲基化也显示了该指标有成为独立预后危险因素的趋势。

甲基转移酶对鼻咽癌细胞中DLC-1基因表达的影响

肝癌缺失基因-1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)在多种肿瘤中呈现表达缺失或表达下调,这种异常表达主要与由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)参与的启动子区异常甲基化有关。RT-PCR结果显示DLC-1在永生化鼻咽上皮细胞NP69和干扰DNMTs的5-8F细胞中的表达水平较未干扰的鼻咽癌细胞明显升高。甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSPCR)结果则表明DLC-1启动子区在表达下调或缺失的鼻咽癌细胞中均存在异常高甲基化,而干扰DNMTs后5-8F细胞中DLC-1启动子区甲基化状态被逆转,其中特异性干扰DNMT1后效果略为显著,提示DNA甲基转移酶活性对于鼻咽癌中DLC-1启动子区甲基化水平具有重要的调控作用,而DNMT1的调控作用更为突出。

5-碘代杀结核菌素对HT-29细胞DLC-1基因的去甲基化作用

目的探讨5-碘代杀结核菌素(5-iodotubercidin,ITU)对人结肠癌细胞HT-29株增殖凋亡及DLC-1基因表达的影响。方法不同浓度(0.1、0.5、1、2、4、6、8、10μmol/L)ITU作用于HT-29细胞48 h,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测HT-29细胞的增殖活性;ITU(0、2、4、6μmol/L)作用于HT-29细胞48 h,流式细胞仪检测其凋亡率;ITU(0、2、4、6μmol/L)作用于HT-29细胞48 h,亚硫酸氢盐克隆测序法(BSP)检测DLC-1基因启动子区Cp G岛甲基化情况;同上的处理细胞的方法,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肝癌缺失基因-1(deleted in liver cancer-1,DLC-1)mRNA的表达;Western blot检测DLC-1基因蛋白表达。结果 1ITU可明显抑制HT-29细胞活力,在一定范围内随着药物浓度增加抑制细胞活力的作用越强(P<0.05),以6μmol/L组对HT-29细胞影响最大,IC50=(5.92±0.62)μmol/L。2分别以0、2、4、6μmol/L ITU作用于HT-29细胞后,流式细胞仪检测各组凋亡率,分别为(9.56±2.21)%、(22.18±3.16)%、(34.23±3.16)%、(40.50±3.16)%,表明随着ITU浓度增加,对HT-29细胞的促凋亡作用越强。3经0、2、4、6μmol/L ITU处理后DLC-1基因启动子区Cp G岛甲基化率分别为91.67%、75.00%、61.67%、43.33%,表明ITU可以引起DLC-1基因启动子区甲基化程度降低。4在HT-29细胞中可检测到少量DLC-1 mRNA和蛋白的表达;相同条件经0、2、4、6μmol/L ITU处理细胞后检测显示DLC-1基因mRNA和蛋白的表达增加,并随浓度增长,mRNA及蛋白表达随之增加。结论 ITU可抑制人结肠癌HT-29细胞增殖,促进HT-29细胞凋亡,而这种抑制增殖作用可能和ITU降低DLC-1基因启动子区甲基化水平而诱导DLC-1基因上调有关。

DLC-1基因甲基化在骨髓增生异常综合征中的临床意义及地西他滨对DLC-1基因表达的影响

目的检测肝癌缺失基因（DLC-1）在骨髓增生异常综合征（MDS）患者中的异常甲基化情况及异常甲基化对MDS患者DLC-1基因的表达影响；探讨DLC-1基因甲基化对MDS的临床意义及MDS的表观遗传学药物地西他滨对DLC-1基因的表达影响。方法选取福建医科大学附属协和医院血液内科2013至2015年收治的43例MDS患者，采用甲基特异性PCR法（MSP）定性检测MDS患者DIC基因甲基化状态，荧光实时定量PCR（RTFQ-PCR）检测MDS患者DLC-1基因的表达情况；根据MDS的世界卫生组织（WHO）预后积分系统（WPSS积分）标准及危险度分组将MDS患者分为极低危、低危、中危、高危、极高危5组（n＝0、8、7、18、10），探讨DLC-1基因甲基化对MDS患者的临床意义。采用重亚硫酸盐测序PCR（BSP）法定量检测地西他滨作用前、后MDS患者DLC-1基因的甲基化状态，RTFQ-PCR检测MDS患者用药前、后DLC-1基因基因mRNA的表达变化。结果MDS患者DLC-1基因的甲基化比例为55.16%（22/43），DLC-1基因甲基化阳性患者骨髓DLC-1基因mRNA的表达（0.32±0.06）显著低于DLC-1基因甲基化阴性患者（0.91±0.11）（P＝0.008）。对于MDS患者，危险度分层中、高危患者的DLC-1基因甲基化率为21/35，明显高于低危患者的1/8（P＝0.006）。8例采用含地西他滨治疗方案（地西他滨20 mg/m^2，共5 d，28 d为1疗程，4疗程以上）的患者治疗前、后的DLC基因甲基化率分别为57.50%±5.11%和14.13%±2.07%（P＝0.010），DLC-1基因mRNA表达分别为0.28±0.06和0.67±0.08（P＝0.015），差异均有统计学意义。结论DLC-1基因甲基化在MDS患者中较为常见，且可能与不良预后相关；表观遗传学治疗药物地西他滨可逆转MDS患者DLC-1基因异常甲基化状态，使DLC-1基因表达上调，恢复其活性，可能是地西他滨治疗MDS患者的机制之一。

多发性骨髓瘤患者DLC-1基因甲基化及三氧化二砷诱导DLC-1基因去甲基化的研究

目的探讨人多发性骨髓瘤（MM）肝癌缺失基因1（DLC-1）启动子区CpG岛甲基化情况，以及三氧化二砷（As2O3）诱导DLC-1基因的去甲基化作用。方法采用甲基特异性PCR法（MSP）定性检测2008至2012年来自福建医科大学附属协和医院血液内科的52例MM患者DIC基因甲基化状态，反转录（RT）-PCR检测MM患者和人骨髓瘤U266细胞系DLC-1基因的表达情况；采用重亚硫酸盐测序PCR（BSP）法定量检测As203作用前、后人骨髓瘤细胞株U266其DLC-1基因的甲基化状态；荧光定量PCR检测U266细胞用药前、后DLC-1基因、DNA甲基转移酶基因（DNMTl、DNMT3a、DNMT3b）mRNA的表达变化。结果MM患者DLC-1基因的甲基化比例为71.15％（37／52）。U266细胞DLC-1基因呈甲基化，DLC-1基因不表达；经0.5、1.0、2.0pμmol／L As203作用后72h U266细胞DLC-1基因甲基化率由95.38％下降至63.07％、30.00％及7.69％；荧光定量PCR检测经0.5、1.0、2.0pμmol／L As2O3作用后72hU266细胞DLC-1基因mRNA表达与未加药组相比分别为其（1.60±0.09）、（3.66±0.17）、（5.29±0.15）倍，而DNMTl、DNMT3a、DNMT3b基因mRNA表达下调（均P〈0.05）。结论DLC-1基因甲基化在MM患者中较为常见，这可能为MM的诊断和治疗提供借鉴；As2O3可诱导DLC-1基因去甲基化，使DLC-1基因表达上调，恢复其活性，为MM去甲基化治疗提供新思路。

肝癌缺失基因1(DLC-1)甲基化在多发性骨髓瘤患者中的临床意义

目的探讨肝癌缺失基因1(DLC-1)启动子区CpG岛甲基化在多发性骨髓瘤(MM)患者中的表达及相关临床意义。方法采用重亚硫酸盐测序PCR(BSP)法定量检测自2016年10月—2017年12月在新疆医科大学附属肿瘤医院初诊的30例MM患者DLC-1基因的甲基化状态,分别进行MM患者的临床资料分析、MM患者及健康对照组关于DLC-1基因甲基化情况的比较,以及MM患者DLC-1基因甲基化情况与相关临床指标的比较。结果(1)临床资料有关M蛋白的免疫分型提示:30例MM患者中IgG型21例(21/30),IgA型6例(6/30),轻链型3例(3/30);骨髓细胞学检查提示:MM患者中骨髓瘤细胞比例<30%的有6例(21/30),30%~50%之间的有19例(19/30),≥50%的有5例(5/30)。(2)MM组与对照组比较提示:MM组DLC-1启动子区甲基化率显著高于正常组(P=0.009),其中CpG岛4、6、7、13、21位点的甲基化率显著高于正常对照组(P值分别为0.017、0.030、0.023、0.017、0.044)。(3)进一步对MM患者深入比较发现,DLC-1基因的甲基化比例分别在Ⅱa+Ⅲa期与Ⅲb期组间、血清肌酐正常与升高患者组间、骨髓异常浆细胞/骨髓瘤细胞比例50%≥与<50%组间均存在统计学差异(P均<0.05)。结论DLC-1异常甲基化可能与肿瘤负荷及肾功能损害相关,深入研究有关DLC-1基因甲基化在MM患者中的表达情况,可为今后MM的去甲基化治疗提供新的研究思路。

肝癌中医证型与DLC-1基因甲基化表达的相关性研究

目的:探讨肝癌不同证型与DLC-1基因甲基化表达的相关性。方法:63例肝癌患者依据中华人民共和国国家标准,从瘀论治分为肝郁(气滞)血瘀证、肝气虚血瘀证、肝瘀痰结(阻)证和肝胆湿热瘀滞证;采用荧光定量PCR方法检测患者治疗前及治疗后外周静脉血DLC-1基因甲基化表达在肝癌各证型的分布情况,并进行统计分析。结果:(1)研究发现肝癌患者各证型都有DLC-1甲基化阳性反应,阳性率从高到低依次为:肝瘀痰结组>肝郁血瘀组>肝胆湿热组>气虚血瘀组;(2)统计学分析四组证型之间DLC-1甲基化表达没有明显的差异性,无统计学意义(P>0.05)。结论:肝癌中医证型的分布可能与DLC-1基因有关,有待进一步的研究。

抑癌基因DLC-1的研究进展

DLC-J(frequently deleted in liver cancer)基因是新发现的一个肿瘤抑制基因,它的失活有可能参与肿瘤的发生和发展。本文拟就DLC-1基因的结构功能及其在遗传和表遗传方面的失活机制作一综述。

DLC-1和SGCZ基因单核苷酸多态性对惠阳胡须鸡生长性状的影响

为了解肝癌缺失基因-1(DLC-1)和泽塔-肌聚糖蛋白(SGCZ)基因单核苷酸多态性对惠阳胡须鸡生长性状的影响,以惠阳胡须鸡作为试验材料,从鸡血液中提取DNA,然后通过PCR-RFLP分析DLC-1和SGCZ基因单核苷酸多态性与生长性状的关系。结果表明:93日龄惠阳胡须鸡的DLC-1基因中GG基因型的体重与AA基因型相比差异不显著(P>0.05),但GG基因型个体比AA基因型多16.68 g;93日龄惠阳胡须鸡的SGCZ基因中AG基因型的体重与AA基因型相比差异不显著(P>0.05)。DLC-1和SGCZ基因限制酶切片段长度多态性对93日龄惠阳胡须鸡的体重无显著影响;但DLC-1基因中GG基因型、SGCZ基因中AG基因型的93日龄样本平均体重最大,比DLC-1基因中AA基因型和SGCZ基因中AG基因型的平均体重多49.62 g。说明DLC-1基因的优势基因型为GG基因型,DLC-1和SGCZ基因的优势基因型组合为DLC-1基因中GG基因型和SGCZ基因中AG基因型,可作为惠阳胡须鸡早期基因型选择的参考依据。

AFP—L3、GP73及DLC-1在原发性肝癌中的研究进展

原发性肝癌由于缺乏特异性和灵敏度均高的标志物，确诊时已多属中、晚期，又由于缺乏有效治疗，因而预后差。近年来，肝癌相关基因和蛋白标志物大量涌现，本文就AFP—L3、GP73及抑癌基因DLC-1（deleted in liver cancer-1）与肝癌发生发展的关系进行阐述，为肝癌的早期诊断和判定预后提供一些新的线索。