苦参碱对HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长的影响

目的:探讨苦参碱能否重新诱导HepG2细胞DLK1基因被印记及对细胞生长的影响。方法:RT-PCR检测不同浓度苦参碱处理HepG2细胞后DLK1基因表达水平变化;MTT、transwell和流式细胞术检测苦参碱作用后HepG2细胞的增殖、凋亡及侵袭力的变化。结果:HepG2细胞经苦参碱处理后,DLK1基因的mRNA表达量降低,细胞的增殖能力、侵袭能力均降低,细胞抑制在G1期。结论:苦参碱能有效地抑制DLK1基因的表达,且能抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖和侵袭能力。

5-Aza-CdR抑制HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对DLK1基因及肝癌细胞系HepG2增殖、侵袭的影响。方法不同浓度的5-Aza-CdR及PBS作用HepG2细胞后,RT-PCR、Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平;MTT、Transwell和流式细胞术检测HepG2细胞的生长、侵袭力及细胞周期的变化。结果 HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,DLK1 mRNA、蛋白表达量降低;MTT试验显示细胞生长速度依5-Aza-CdR浓度出现不同程度减慢;流式结果表明G1期细胞减少,S期细胞增加,出现S期阻滞;Transwell证实侵袭能力显著降低(P<0.05)。结论去甲基化药物5-Aza-CdR能有效地抑制DLK1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖、侵袭能力。

鸡DLK1基因的生物信息学分析

DLK1基因是哺乳动物的一个印记基因,DLK1蛋白促进哺乳动物肌肉的生长发育,但抑制脂肪的生长发育。禽类不存在基因组印记现象,目前禽类DLK1基因的功能和调控机制还不清楚。本研究针对鸡等13种动物的DLK1蛋白进行了多序列比较分析、分子进化分析及糖基化分析,同时还比较了人、鼠及鸡的DLK1基因结构、基因同线性、启动子结构以及3′端非编码区结构。结果表明,尽管鸡和人DLK1基因的进化关系较远,但从mRNA拼接形式、基因结构、启动子结构等来看,与鼠相比,鸡和人的DLK1基因有较多相似之处。研究结果为下一步鸡DLK1基因的功能和调控研究提供了参考依据,同时,也为印迹基因的进化研究以及鸡的脂肪生长发育研究奠定了基础。

人类DLK1基因的克隆、表达、纯化及抗体制备

目的构建人类DLK1基因的原核表达载体,表达并纯化蛋白,制备多克隆抗体,为研究DLK1基因的功能奠定基础。方法从GenBank中下载人类DLK1基因全长cDNA序列并针对不含信号肽的编码序列设计引物,应用RT-PCR获得目的片段,重组入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达,应用亲和层析法获得重组DLK1蛋白免疫大鼠制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体滴度。结果成功构建了DLK1基因重组表达载体pET-28a-DLK1,表达的重组蛋白纯化经SDS-PAGE鉴定后免疫大鼠,得到了高滴度的多克隆抗体。结论成功的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备为进一步研究DLK1基因的功能及其在肝肿瘤中的作用提供了基础。

5个绵羊品种DLK1基因多态性与生长性状的关联性分析

为挖掘与绵羊生长性状相关的分子标记基因,探究DLK1多态性与绵羊生长性能之间的关联性。以240头不同品种绵羊(甘肃高山细毛羊、蒙古羊、藏绵羊和小尾寒羊各50头,滩羊40头)为试验对象,分别测定不同品种各年龄段绵羊生长性能指标;采集绵羊血液,提取DNA,运用PCR-SSCP方法结合DNA测序技术分析不同品种绵羊DLK1基因多态性;SPSS 20.0软件分析不同基因型与各绵羊品种不同年龄段生长性能之间的相关性。结果表明,不同品种绵羊DLK1基因均具有多态性,其中共检测到2个等位基因(A和B)和3种基因型(AA、AB和BB),优势等位基因和基因型分别为B和AB;DLK1基因第5内含子30412 bp处发生G→A单个碱基突变;G30412A突变位点与绵羊1月龄和3月龄的体质量和胸围具有显著相关性(P<0.05),且BB基因型个体表型优于AA基因型个体,突变位点与绵羊体长和体高无相关性(P>0.05)。总之,不同品种绵羊DLK1基因均存在第5内含子上G30412A突变位点,该位点显著影响绵羊1,3月龄的体质量和胸围,其可作为选择甘肃地方绵羊品种生产性状的候选基因。

藏山羊DLK1基因的组织表达谱与肌内脂肪相关性分析

为了研究藏山羊DLK1基因组织表达谱和肌肉组织中DLK1 mRNA表达与肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量的相关性,试验采用实时荧光定量PCR方法检测DLK1基因在藏山羊不同组织中的表达和与肌肉关联性分析。结果表明:DLK1基因在藏山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌、腿肌和臂三头肌中均有表达,其中在肾脏中表达量最高,在肺脏中表达量最低。相关性分析结果表明,藏山羊背最长肌、腿肌和臂三头肌中DLK1 mRNA表达与肌内脂肪含量分别呈不显著正相关(R=0.226,P>0.05)、显著正相关(R=0.759,P<0.05)和显著负相关(R=-0.792,P<0.05)。说明DLK1基因可能对藏山羊肌内脂肪沉积具有重要的调控作用。

骨髓增生异常综合征患者骨髓CD3＋T细胞TET2和DLK1基因表达及其临床意义

目的探讨骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓CD3＋T细胞TET2及DLK1基因的表达水平及其临床意义，为进一步阐明MDS细胞免疫异常的机制提供依据。方法应用免疫磁珠分选骨髓CD3＋T细胞，应用实时荧光定量PCR（qPCR）检测26例MDS患者和16例正常对照骨髓CD3＋T细胞中TET2和DLK1mRNA的表达水平，分析它们与临床特征之间的相关性。结果MDS患者骨髓CD3＋T细胞中TET2mRNA表达是正常对照组的（0．16±0．15）倍（P〈0．01）；TET2mRNA表达水平与血清补体C3呈显著正相关（r=0．404，P〈0．05）；MDS患者骨髓CD3＋T细胞中DLKlmRNA表达是正常对照组的（1．61±0．88）倍（P〈0．05）；依据染色体分组，染色体异常组DLK1表达水平是染色体正常对照组的（1．45±0．44）倍（P〈0．05）；DLK1mRNA表达水平与骨髓原始细胞比例呈显著正相关（r=0．343，P〈0．05）。结论MDS患者骨髓CD3＋T细胞中TET2mRNA表达降低，DLK1mRNA表达增高，提示CD3T细胞有质的异常，这可能是导致机体免疫监视功能下降的机制之一。

DLK1基因的单核苷酸多态性与绵羊生长发育性状的相关性分析

对宁夏滩羊、得克塞尔、萨福克3个绵羊群体DLK1-GTL2印记化结构域的DLK1基因部分片段进行PCR-SSCP检测,结果表明:共检测到5个突变位点,分别为54507处的G→C突变、54553处的T→C突变、54592处的C→T突变、54620处的C→T突变、54638处的T→G突变,表现为5种单倍型D-1、D-2、D-3、D-4、D-5。对DLK1基因各SNP位点进行统计学分析表明,D1和D2、D3、D4、D5位点,D2和D3、D4、D5位点,D3和D5位点间存在强的连锁不平衡(P<0.01)。DLK1基因不同单倍型之间对宁夏滩羊、得克塞尔和萨福克群体的生长发育性状影响不显著(P>0.05)。

DLK1和MSTN基因在绵羊妊娠中后期胎儿中的表达分析

本研究以2个骨骼肌表型差异明显的特克塞尔和乌珠穆沁绵羊为试验对象,研究DLK1和MSTN基因在不同妊娠阶段胎儿不同部位骨骼肌中表达的调控机制及早期肌肉发育规律。在绵羊妊娠第85、100、120和135天时,对胎儿的半腱肌、半膜肌、背最长肌、股四头肌和股二头肌肌肉质量进行方差分析以及对DLK1和MSTN基因在5种骨骼肌中的表达量进行研究。结果表明,妊娠85天时特克塞尔羊的半膜肌、背最长肌、股四头肌和股二头肌质量显著或极显著(P<0.05或P<0.01)高于乌珠穆沁羊;妊娠100天时,5种骨骼肌组织生长发育在品种间的差异达到最大(P<0.05或P<0.01)。实时荧光定量分析表明,随着胎儿日龄的增加,DLK1基因在半腱肌、半膜肌、背最长肌、股四头肌和股二头肌骨骼肌中的表达量有增加的趋势,同时在特克塞尔羊中的表达量高于乌珠穆沁绵羊。在妊娠120天的半腱肌和半膜肌、妊娠100和135天的背最长肌、妊娠85天股四头肌和妊娠135天的股二头肌中DLK1表达量在2个品种间差异显著(P<0.05)。MSTN的表达量在特克塞尔羊中高于乌珠穆沁羊,但整体较低。妊娠135天时背最长肌和股四头肌中MSTN基因的表达量在2个品种间差异显著(P<0.05)。结果显示,DLK1和MSTN基因在不同日龄不同肌肉组织中的差异表达可能与肌肉早期发育有关。

牛DLK1基因的生物信息学分析

DLK1基因是位于DLK1-DIO3印记区域内一个父源表达的印记基因。本研究利用生物信息学方法对牛DLK1基因进行了分子进化分析、基因和蛋白质结构分析并预测了其启动子和CpG岛区域。对7种动物DLK1基因mR NA序列的分子进化分析结果显示,牛与羊的遗传距离最小,亲缘关系最近。蛋白质在线分析软件表明,DLK1蛋白由信号肽、EGF结构域以及跨膜区组成。牛DLK1基因包含5个外显子,且存在多种可变剪切体。启动子在线软件预测,牛DLK1核心启动子可能位于该基因起始密码子上游1 790~1 840 bp处。预测结果表明,人、小鼠和牛三个物种DLK1潜在的核心启动子区所处的位置具有一致性,并且三个物种的启动子区DNA序列具有高度保守性。以上研究结果为进一步阐明牛DLK1基因的生物学功能及其印记调控机理提供了参考依据。

重组腺病毒介导RNA干扰人DLK1基因表达的研究

构建抑制人DLK1基因表达的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术评价其在肝癌细胞株中的基因沉默效应.将针对人DLK1基因的RNAi寡核苷酸序列,连接到腺病毒穿梭质粒中,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183内进行同源重组.重组腺病毒载体在HEK-293细胞中包装扩增,得到高滴度的重组腺病毒.通过绿色荧光蛋白示踪腺病毒的感染效果,并通过荧光实时RT-PCR,Western blot的方法证实重组腺病毒能够显著抑制DLK1基因在肝癌细胞株中的表达.

印记基因Dlk1在小鼠胚胎发育中的表达分析

目的:研究印记基因Dlk1在小鼠胚胎发育过程中的动态表达模式,以揭示Dlk1与胚胎发育的关系。方法:通过半定量PCR和定量PCR分析Dlk1在小鼠胚胎发育E8.5～E19.5的基因表达模式,并选取Dlk1表达量最高的时期进行胚胎切片原位杂交和组织定量PCR分析。结果:在小鼠胚胎发育E8.5～E15.5时,Dlk1的表达逐渐升高,在E15.5时表达量达到最高;E15.5～E19.5时,Dlk1表达有所下降,但仍然维持较高水平。E15.5切片原位杂交显示,垂体、肺脏、软骨、舌和背侧肌肉组织中Dlk1表达较高,组织定量PCR实验进一步证实了原文杂交的结果。结论:Dlk1在小鼠胚胎发育中后期持续表达,并呈现一定的组织特异性,对胚胎发育可能起重要的调节作用。

原发性肝癌组织中DLK1表达及意义

目的探讨DLK1在原发性肝细胞性肝癌(HCC)发生、发展中的作用。方法分别应用免疫组化SP法和原位杂交的方法检测150例原发性肝细胞癌、50例肝硬化、50例肝炎组织中和10例意外死亡(生前体健)者肝组织中DLK1表达。结果 DLK1蛋白及DLK1 mRNA在HCC中的表达明显高于肝硬化?肝炎和正常肝组织表达(P均<0.05)。DLK1蛋白表达与肿瘤直径及临床分期有明显相关性(P均<0.05)。结论 DLK1高表达可促进HCC的发生、发展。

DLK1过表达对3T3细胞在裸鼠体内成瘤性的影响

目的:探讨DLK1过表达对3T3细胞成瘤性的影响。方法:病毒感染法建立3T3-GFP及3T3-DLK1细胞系,集落形成实验检测DLK1过表达对3T3细胞集落形成能力的影响。将2×106 3T3、3T3-GFP和3T3-DLK1细胞分别注入裸鼠肩部皮下,测量所形成肿瘤大小以检测DLK1对成瘤性的影响。结果:DLK1过表达使3T3细胞集落形成能力受到抑制;3T3细胞形成集落数为(87.67±6.51)个/孔,3T3-GFP细胞形成集落数为(83.00±6.08)个/孔,3T3-DLK细胞形成集落数为(24.00±2.65)个/孔;3T3-DLK1细胞在裸鼠体内形成的瘤块显著小于对照组,3T3细胞、3T3-GFP细胞和3T3-DLK细胞在裸鼠体内形成瘤块大小分别为(1 111.0±327.4)mm3、(705.9±415.3)mm3和(79.91±19.32)mm3(P<0.05)。结论:DLK1过表达抑制3T3细胞在裸鼠体内的成瘤性,DLK1可能作为抑癌基因发挥作用。

骨髓增生异常综合征相关基因表达研究

本研究探讨骨髓增生异常综合征(MDS)患者c-FLIPL,c-FLIPS及DLK1的表达水平及临床意义。应用逆转录-聚合酶(RT-PCR)半定量检测16例骨髓增生异常综合征患者及3例对照者(非恶性血液病患者)骨髓单个核细胞中c-FLIPL,c-FLIPS及DLK1 mRNA的表达水平。结果表明:DLK1 mRNA在MDS患者中表达明显高于对照组,包括RA及RAEB患者的表达量,均具有统计学差异(p<0.05),而RA及RAEB患者之间的表达无统计学差异(p>0.05);c-FLIPL mRNA在MDS患者中表达高于对照组(p<0.05),其中RA及RAEB患者均明显高于对照组(p<0.05),而RA及RAEB患者之间表达无显著性差异(p>0.05);c-FLIPS mRNA表达在MDS患者中表达增高,但与对照组相比无统计学差异(p>0.05),而RAEB患者的表达量明显高于RA及对照组,结果具有统计学差异(p<0.05)。结论:DLK1,c-FLIPL,c-FLIPS基因在MDS患者骨髓单个核细胞中表达存在异常,有些基因可以作为判断MDS发生、发展的一项指标。

DLK1及c-FLIP基因在AML中的表达

目的探讨急性髓细胞白血病(AML)患者c-FLIPL、c-FLIPS及DLK1基因的表达水平及临床意义。方法应用逆转录-PCR半定量检测8例AML(AML组)及3例非恶性血液病患者(对照组)骨髓单个核细胞中c-FLIPL、c-FLIPS及DLK1 mRNA的表达水平。结果 AML组患者DLK1 mRNA、c-FLIPL mRNA、c-FLIPS mRNA表达均明显高于对照组(P<0.05),且AML各FAB亚型间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 DLK1、c-FLIPL及c-FLIPS基因在AML患者中表达异常增高,可能在白血病细胞逃脱凋亡、无限增殖中发挥作用。

遗传缺陷致中枢性性早熟病因学的研究新进展

中枢性性早熟(central precocious puberty,CPP)是下丘脑-垂体-性腺轴提早激活所导致的发育异常性疾病,其发病率快速增加,但发病机制尚未完全明确。既往研究发现KISS1R、KISS1基因的功能获得性突变,以及MKRN3、LIN28和DLK1基因的功能缺失性突变可导致青春发育期启动时间提前。新近研究发现表观遗传因素如DNA甲基化、微小核糖核酸在促性腺激素释放激素神经元的调控中起重要作用;基因网络中多个变异基因的协同作用也可影响青春发育启动。该文综述了导致CPP的遗传学病因进展及其致病机制。

妊娠期全氟辛酸染毒对子代雄鼠发育毒性的研究

探讨妊娠期染毒全氟辛酸(perfluorooctanoic acid,PFOA)对子代雄鼠发育毒性的影响.将50只妊娠0 d小鼠随机分5组,每组10只,妊娠0~17 d每天按0、1、2.5、5和12.5 mg·kg^(-1)BW饲喂PFOA,产后仔鼠正常饲养,记录仔鼠存活数.产后21 d,检测仔鼠血清睾酮水平并计算睾丸指数;HE染色观察睾丸组织结构变化;RT-PCR法检测睾丸组织Dlk1-Dio3印记基因簇各目的基因mRNA的表达情况.结果显示,随PFOA染毒剂量增加,仔鼠存活数显著降低,血清睾酮含量极显著性降低(p<0.01);睾丸指数无统计学意义;睾丸组织有不同程度的损伤并呈剂量依赖性;Dlk1-Dio3印记基因簇各目的基因的表达量都有降低趋势,其中Gtl2、Rian、Dio3均显著性降低(p<0.05).结果表明,妊娠期染毒PFOA能够降低仔鼠存活数,损伤睾丸组织结构,并能够扰乱生殖激素,降低睾丸组织Dlk1-Dio3印记基因簇各目的基因mRNA的表达.