pSiRNA-Dll4逆转录病毒载体的构建及对骨肉瘤UMR106细胞Dll4蛋白表达的作用

目的建立逆转录病毒介导的人Dll4基因RNA干扰体外表达体系并观察对骨肉瘤UMR106细胞的作用。方法将人Dll4基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒psilencer5.1-H1Retro中,构建成携带人Dll4基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Dll4,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染骨肉瘤细胞UMR106,用Westernblot分别检测对转染细胞人Dll4蛋白表达的影响。结果重组pSiR-NA-Dll4质粒经测序鉴定正确。重组逆转录病毒滴度可达221×104cfu/mL,感染UMR106骨肉瘤细胞3d能明显抑制细胞Dll4蛋白表达,其表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论成功构建了沉默Dll4表达的载体pSiRNA-Dll4,并且该载体能有效地敲低骨肉瘤细胞Dll4基因表达。

DLL4/Notch1配体过表达抑制K562细胞生长机制研究

本研究旨在探讨Notch1信号通路的配体delta-like ligand 4(DLL4)基因过表达对K562细胞增殖的影响及其可能的作用机制。采用脂质体介导将含配体DLL4基因的质粒pBudCE4.1-DLL4转染K562细胞,通过RTPCR和Western blot检测转染48 h后DLL4基因的mRNA及蛋白表达,同样检测转染后Notch1受体胞内区(NICD)、下游靶基因Hes1的mRNA及蛋白表达;通过Western blot检测与Notch信号通路相关的细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达水平;用CCK-8法检测转染后细胞的增殖情况;用流式细胞术检测转染质粒48 h后各组细胞的凋亡情况。结果表明,DLL4基因转染后的K562细胞中DLL4、NICD及下游靶基因Hes1的mRNA及蛋白表达量比对照组明显增多(P<0.05),说明DLL4的过表达激活了Notch1信号通路;Western blot方法检测显示,DLL4的转染增加了细胞转录因子YY1、原癌基因C-MYC及抑癌基因Rb蛋白的表达,从而抑制了K562细胞的生长,诱导细胞周期停滞于G1期及细胞凋亡的增加。结论:外源性DLL4基因过表达可有效活化K562细胞内Notch1信号通路,可能通过YY1、C-MYC及Rb等Notch信号通路相关基因的高表达诱导K562细胞的生长减慢及细胞凋亡。

DLL4基因对白血病细胞株K562细胞中YY1和c-Myc蛋白表达及细胞增殖的影响

本研究旨在探讨Notch的配体DLL4基因在白血病细胞株K562中对转录因子YY1和原癌基因c-Myc蛋白表达及细胞生长的影响。实验分正常对照组、阴性对照组(转染质粒pBudCE4.1)和实验组(转染质粒pBudCE4.1-DLL4)。转染后48小时,用免疫印迹法和免疫细胞化学法检测外源性DLL4瞬时转染表达水平及YY1和c-Myc蛋白的表达水平;用细胞计数试剂盒-8法检测各组细胞的增殖;转染后48小时用流式细胞仪检测各组细胞的周期分布和凋亡。结果表明,在各组K562细胞中均检测到DLL4、YY1和c-Myc蛋白的表达,实验组的DLL4、YY1和c-Myc蛋白表达量比两个对照组显著增多(p<0.05);实验组K562细胞的生长速度明显低于对照组;实验组较对照组G0/G1期细胞增多(p<0.001),凋亡率增加(p<0.001)。结论:DLL4基因能增加细胞转录因子YY1和原癌基因c-Myc蛋白的表达,诱导细胞生长速度减慢、细胞周期停滞于G0/G1期,并能增高凋亡率增加。