TET2重塑CXCR4 DNA甲基化对急性心肌梗死小鼠心肌组织自噬、炎症反应及凋亡的影响

目的:探究急性心肌梗死(AMI)过程中内皮细胞tet甲基胞嘧啶双加氧酶2(TET2)对趋化因子受体4(CXCR4)DNA甲基化的影响以及对AMI小鼠心肌组织自噬、炎症反应及组织细胞凋亡的影响机制,为临床探究AMI发展的分子机制提供理论依据。方法:8周龄雄性C57/BL6小鼠50只,制备AMI模型,尾部注射TET2、CXCR4过表达质粒;蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测心肌组织TET2、CXCR4、微管相关蛋白3(LC3)、P62、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)关联X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bcl-2表达;甲基化检测CXCR4 DNA甲基化水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测心肌组织内炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测各组心肌组织细胞凋亡指数。结果:与假手术组比较,模型组心肌组织内TET2、CXCR4均表达上调,TET2、CXCR4均在心肌组织内过表达,TET2过表达促进CXCR4表达,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,TET2 mimic组CXCR4启动子区域DNA甲基化程度降低,CXCR4蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与假手术组比较,模型组小鼠心肌组织自噬蛋白LC3、抑制细胞凋亡蛋白Bcl-2表达下调,炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平、自噬蛋白P62、促细胞凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);TET2、CXCR4过表达进一步下调LC3、Bcl-2蛋白表达,上调炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平,P62、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达;TET2、CXCR4二者联合体现出最低LC3、Bcl-2蛋白表达,最高炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平以及P62、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:AMI发展中,TET2通过降低CXCR4 DNA甲基化,促进CXCR4基因表达,进而抑制AMI小鼠心肌组织自噬,上调炎症反应及细胞凋亡程度,促进疾病发展。

基于i-motifDNA构型变化和纳米金紫外-可见吸收光谱的pH测定研究

利用纳米金对DNA构型的区分效应设计了一种快速灵敏可视化的pH计。对i-motif DNA-纳米金体系的紫外可见吸收光谱变化进行了系统研究,考察了盐浓度、i-motif DNA浓度、四重体形成时间以及DNA序列对pH响应的影响。在既定条件下,纳米金的紫外-可见吸收光谱在pH 5.3～7.0范围内呈现规律性变化,在520nm处的吸光度逐渐增大,在700nm处的吸光度逐渐减小,纳米金的颜色逐渐由蓝紫色变化至红色。该pH计具有纳米金无需修饰、可视化、成本低、速度快等特点,有望用于某些pH值发生变化的生命过程的监测。

三联吡啶及其Pt(Ⅱ)配合物与i-motif DNA相互作用的研究

本文通过荧光滴定、紫外可见吸收滴定、紫外熔点实验以及CD光谱研究了三联吡啶衍生物L1-L3及其Pt(Ⅱ)配合物1-3和人端粒i-motif DNA的相互作用。结果表明:配体和配合物均能与i-motif DNA相互作用,结合常数约为105M-1,而且配合物的亲和作用强于配体。配合物的结合导致i-motif DNA的熔点温度降低并对其构象产生扰动。

中华按蚊中基于卵巢导向肽和Gal4-UAS结合特性的外源DNA投递系统构建

【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点,在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2C-Gal4-DsRed在卵巢中的投递效率;制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白,构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒,通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合;分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA,并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光,表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中;P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合;分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递,这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。

BCG-CpG-DNA制备、理化特性及免疫刺激活性的初步研究

采用机械破碎、CTAB沉淀、酚:氯仿:异戊醇抽提法从卡介菌(BCG)中制备BCG-CpG-DNA,经化学方法确定其理化成分,通过双抗体夹心ELISA法检测小鼠IgM水平检测其免疫刺激活性.结果显示每克半干重的卡介菌提取BCG-CpG-DNA约0.9mg.提取物主要成分为BCG-CpG-DNA,分子量大小在3 000～15 710 bp,含少量的多糖和蛋白;紫外分光扫描在260nm有最大吸收;对特异性识别DNA长链的CCGG中的CpG位点的限制性内切酶HpaⅡ高度敏感;能够活化小鼠B细胞产生IgM.所制备的BCG-CpG-DNA含较多的未甲基化CpG基序,具有免疫刺激活性功能.

CpG基元在细菌DNA诱导小白鼠THP-1释放细胞因子中的作用

目的 探讨CpG基元在细菌DNA诱导的细胞因子释放中的作用。方法 实验前 1h经腹腔注射 60 0mg/kgD 氨基半乳糖 (D Galactoamine ,D GalN)敏化小鼠 ,采用纯化的大肠杆菌DNA(EscherichiacoliDNA ,ECDNA)、小牛胸腺DNA(CalfthymusDNA ,CTDNA)、含有CpG基元的硫代寡核苷酸 (CpG oligodeoxynucleotides ,CpGODN )和C与G序列颠倒的硫代寡核苷酸 (Non CpGODN )静脉给予小鼠 ,DNA的注射剂量为 3 0mg/kg ,ODN的剂量为 10nmol/只 ,观察ECDNA、DNA、CpGODN与CTDNA、NON CpGODN导致小鼠死亡情况的差异。体外培养THP 1细胞系 ,在THP 1细胞培养体系中加入上述制剂后 ,测定细胞因子TNF α、IL 6、IL 1β的释放情况 ,观察上述制剂诱导细胞因子释放能力的不同。 结果 ECDNA、CpGODN可诱导小鼠的死亡以及细胞因子的大量释放 ,而CTDNA、NON CpGODN则无此能力。结论 含有CpG基元的寡核苷酸具有诱导巨噬细胞大量释放细胞因子的作用 ,CpG基元在细菌DNA诱导的细胞因子释放中具有重要的作用 。

d(C4)相关序列形成四分子i-Motif结构的电喷雾质谱研究

设计了与富含胞嘧啶(C)的DNA序列d(C4)相关的DNA序列d(C4),d(TC4),d(AC4),d(T2C4),d(A2C4),d(C4T),d(C4A)和d(TC4T);采用电喷雾质谱测定发现这些序列形成四分子非共价复合物离子,根据离子的相对丰度可确定形成四链i-motif结构的数量和可能性;同时考察了腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)在d(C4)序列的5'和3'端对其形成四分子i-motif结构的影响.结果表明,在d(C4)的5'端增加A碱基或T碱基更易形成四分子复合物;5'端含T碱基比含A碱基更利于形成四分子复合物;而在d(C4)序列中增加2个A碱基或T碱基比增加相应的单个碱基形成了更高丰度的四分子离子峰.

CpG基序对新城疫病毒DNA免疫效果的影响

为评价CpG基序对新城疫病毒(NDV)DNA免疫效果的影响,本研究将NDVF48E9株的F基因分别克隆至真核表达载体pVAX1和含有3个CpG基序的载体pVAX1-CpG中,分别命名为pV-F和pVC-F,体外表达检测结果显示,pV-F和pVC-F外源基因表达量无明显差别。将pVAX1、pVAX1-CpG、pV-F和pVC-F经腿部肌肉多点注射3周龄SPF鸡(200μg/只),2周后以相同的剂量加强免疫,二免后2周通过滴鼻以103EID50NDV的F48E9强毒株进行攻毒。抗体检测结果表明,免疫组的抗体水平与对照组相比差异显著(p<0.01),pVC-F免疫组的抗体水平高于pV-F免疫组;淋巴细胞检测结果表明,pV-F和pVC-F免疫组与对照组显著差异(p<0.01);攻毒保护率结果显示,pVC-F和pV-F组的保护率分别为60%和50%,对照组为0。以上结果表明,CpG基序对机体细胞免疫反应有一定的增强作用。

通过T-A克隆技术构建含免疫刺激序列CpG基序的抗SBR DNA疫苗(英文)

目的 :构建含免疫刺激序列、能够阻止变形链球菌在牙面粘附的防龋DNA疫苗。方法 :根据原核表达质粒 pS BR CTA2 B基因序列 ,设计针对编码变形链球菌表面蛋白抗原AgⅠ /Ⅱ分子中唾液蛋白结合区段 (SBR)的特异性PCR引物 ,利用PCR技术由质粒 pSBR CTA2 B扩增目的DNA片断 ;通过T A克隆技术将目的DNA片段克隆于中间载体 pMD1 8 T ,鉴定插入方向后 ,选择插入方向正确的克隆 ,将目的DNA从中间载体释放 ,再克隆至含有CpG免疫刺激序列的真核表达载体pcDNA3 1。结果 :通过对重组质粒pcDNA3 1 SBR进行酶切图谱分析和DNA序列测定分析 ,证明真核表达重组质粒 pcD NA3 1 SBR构建成功、开放阅读框架正确。结论 :利用T A克隆等技术可成功将编码SBR的DNA片段克隆到含有免疫刺激序列CpG的真核表达载体 pcDNA3 1的适当部位 ,构建出真核表达重组质粒pcDNA 3 1

拮抗细菌DNA的CpG-N ODN筛选

目的在抑制性CpG寡核苷酸(CpG-NODN)分子设计的基础上,选择部分序列加以合成并对其生物学活性进行鉴定,筛选出能够拮抗细菌DNA的CpG-NODN。方法对合成的10条CpGODN进行生物学活性的初筛和复筛,观察其自身的刺激性及其对CpG-SODN诱导的TNF-α释放的抑制作用。使用RNAstructureversion3.71预测CpGODN的二级结构及自由能,根据10条CpGODN构效关系分析结果,对CpG-NODN分子进行再设计,并从中选择11个序列进行生物活性的筛选。结果首次合成的10条CpGODN仅1条是对细菌DNA拮抗作用较弱的CpG-NODN。通过对其构效关系进行分析,推测CpGODN的生物活性可能与自由能相关。在此基础上对CpG-NODN分子进行了再设计,合成的11条CpGODN中有5条是拮抗作用较强的CpG-NODN。结论获得了6条CpG-NODN。CpGODN的生物活性可能与自由能密切相关。

2型、5型腺病毒DNA与12型腺病毒DNA、大肠杆菌DNA序列的对比研究

目的通过对2型、5型人腺病毒DNA(Adv2、5DNA)与Adv12DNA及大肠杆菌DNA(ECDNA)序列进行对比研究,确定Adv2、5DNA中能够拮抗细菌DNA的可能的活性片段——抑制性CpG寡核苷酸(CpG-NODN)。方法从NCBI核酸数据库中获取Adv2、5、12DNA和ECDNA序列,采用DNATools、BioEdit等软件对Adv2、5、12DNA和ECDNA进行序列分析和比较,确定Adv2、5DNA特征性的CpG基序,查找出Adv2、5DNA中以上述CpG基序为核心的12碱基寡核苷酸(12-ODN)。结果确定了19种Adv2、5DNA特征性的CpG基序,Adv2、5DNA中以这19种CpG基序为核心的12-ODN共504条。结论504条12-ODN可能是Adv2、5DNA的CpG-NODN。

基于核酸i-motif结构的pH响应荧光传感器

利用核酸i-motif结构对质子的超敏感特性,选择富含胞嘧啶C的核酸链及其互补链,以及染料SYBR Green Ⅰ对单双链DNA的不同荧光响应特性,研制了一种灵敏的新型pH响应荧光传感器。当pH值从5.0变为7.5时,SYBR Green Ⅰ的荧光强度增大了4倍以上,pH传感范围是5.0～7.5,并显示出很高的pH分辨率(0.1个pH单元)。该pH传感器具有简单、快速、成本低等优点,有望用于相关生物过程中微小pH值变化的传感分析。

DNA自组装技术的研究进展及难点(英文)

近年来,DNA自组装成为DNA计算及纳米材料科学等领域研究的热点,它关系着DNA计算机的发展.DNA分子如何组装已成为许多学者关注的焦点.为此,文中主要围绕着DNA分子组装成的初级元件的类型:一条长的DNA单链、多条短寡核苷酸链和自组装单元,重点从自组装的初级元件形成的一维、二维及三维结构上讨论DNA自组装技术与方法.文中讨论了这些技术的原理及应用的研究进展,并且分析了DNA自组装应用于DNA计算的主要难点及解决方案.首先,编码的好坏决定着实验是否能实施;其次,DNA单链之间组装的角度及初级原件之间的连接是影响自组装体产量的关键因素;从具体的实验操作上看,每条DNA单链的浓度比例及退火温度则决定着自组装的成败.随着学科之间的高度交叉,DNA自组装将是材料学、信息学、生物学等领域的重要研究方向,也是推动DNA计算机发展的重要手段.

基于比较基因组学的簸箕柳DNA模体预测

以已完成全基因组测序及组装的模式生物拟南芥和具有很高研究价值的园艺植物柳树(Salix)的全基因组测序为数据源,采用基于位置的基因序列匹配方法,研究了新测序物种簸箕柳(Salix suchowensis)的DNA模体序列,以期为进一步了解柳树乃至林木的基因调控网络提供参考依据。结果表明:此次预测的结果与手工验证的部分簸箕柳的DNA模体一致,该研究发布的基于簸箕柳全基因组的DNA模体预测结果对于杨柳科植物的研究具有重要的意义。

含CpG基元的SARS冠状病毒S-1基因片段DNA疫苗的构建及动物试验

设计了3对含不同数目CpG基元(CpGmotifs)的引物,用SARS冠状病毒(SARSCoV)S1基因片段作为靶基因,通过PCR扩增出目的片段,插入真核表达载体pVAX1中。用电击法把构建好的不同质粒注入相应组BALB/c小鼠的股四头肌,2周后再加强免疫一次。每周分别测定血清IgG1和IgG2a抗体水平。结果,免疫组IgG1和IgG2a抗体浓度以及IgG2a与IgG1的比值均显著增加(P<0.001)。表明所构建的SARSCoVS基因S1片段的真核表达质粒可诱导小鼠产生很强的免疫反应。

硫代修饰的CpG基序及IL-2表达质粒对癌胚抗原DNA疫苗诱导抗体的影响

目的 探讨增强癌胚抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠体内诱导的体液免疫应答的方法。方法 将合成的、经硫代修饰的CpG基序和IL - 2表达质粒分别作为免疫刺激剂与癌胚抗原 (CEA)DNA疫苗一起肌肉注射小鼠 ,ELISA法检测动物体内产生CEA和抗 -CEA的水平。结果 单独以CpG基序或IL - 2表达质粒做免疫刺激剂均不能增加CEA的表达 ,但都能促进抗 -CEA的产生 (P <0 .0 5 )。结论 CpG基序和IL -

血清HBV-DNA定量水平与拉米夫定抗HBV感染中YMDD变异的相关性研究

观察拉米夫定治疗慢性乙型肝炎 (CHB)YMDD变异的产生与血清HBV DNA水平的关系。方法 选择应用拉米夫定治疗并产生YMDD变异的CHB患者 5 3例 ,分析血清HBV DNA水平与YMDD变异类型、产生时间的关系。另选择具有可比性的应用拉米夫定治疗但并未产生YMDD变异的CHB患者 5 3例 (1:1配对 )对比分析治疗前血清HBV DNA定量水平。结果 YMDD变异组治疗前血清HBV DNA定量水平显著高于未产生YMDD变异组 (P <0 .0 1)。YMDD变异类型与血清HBV DNA定量水平不相关 (P >0 .0 5 ) ,但YMDD变异产生时间与血清HBV DNA定量水平相关 (P <0 .0 5 )。结论 CHB患者血清HBV DNA水平越高 ,应用拉米夫定治疗越容易产生YMDD变异 ,且产生时间越早。血清HBV DNA水平可作为应用拉米夫定治疗YMDD变异产生的早期预测指标。YMDD变异类型与血清HBV DNA水平不相关。

异构机群上高效可扩展的Motif发现并行算法

在节点具有不同计算速度、不同通信能力的异构机群系统上,分别建立求解l≤16和l>16的Motif发现问题的最优序列分配模型,在此基础上设计实现融合投票和统一投影-邻居阈值思想的Motif发现并行算法。实验结果表明,给出的基于最优序列分配策略的Motif发现并行算法具有良好的加速和可扩展性,优于采用平均分配策略的Motif发现并行算法。

限制性核酸内切酶与DNA相互作用研究进展

蛋白质对ＤＮＡ识别的模体中，除了锌指结构、螺旋—转角—螺旋、亮氨酸拉链和β带外，近年来发现，Ⅱ型限制性内切酶与ＤＮＡ作用的模体有许多特别之处。通过对ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ等与ＤＮＡ复合物的空间构象、一级结构分析，发现酶分子存在催化性裂缝，并且氨基端形成臂结构包绕ＤＮＡ；同时ＤＮＡ发生构象变化、螺旋扭结。这些有趣的结构有利于酶对底物的特异性结合和催化作用。

一次接种HA DNA保护小鼠抵抗B型流感病毒攻击

为详细探讨小鼠不同次数接种B型流感病毒HA DNA疫苗后免疫应答情况,以及CpG基序的免疫佐剂效果,采用不同剂量HA DNA,1次或2次(间隔3周)电击法免疫BALB/C小鼠。初免4周后(或二免加强免疫1周后)用致死量流感病毒(B/Ibaraki/2/85)攻击。研究发现:①100μg HA DNA一次接种的小鼠全部存活;②经含有CpG基序的DNA免疫的小鼠体内诱导产生的抗HAIgG抗体更高,小鼠体重丢失更少。这些结果说明,1次接种100μg HA DNA疫苗可以使小鼠抵抗致死量B型流感病毒攻击,CpG基序能够增强HA DNA疫苗的免疫保护作用。