基于matK+rbcL+trnH-psbA联合分析法对罂粟属的植物鉴定

目的 利用DNA条形码技术探索罂粟的鉴定方法,寻找可靠的DNA条形码序列对罂粟属植物进行种内和种间的鉴别。方法 采用5种不同种类的虞美人和花菱草作为罂粟鉴别的种内植物、种间植物。利用叶绿体基因组matK、rbcL、trnH-psbA和核糖体基因组ITS2、ITS4、ITS5引物对提取的DNA进行扩增,并双向测序拼接,利用MEGA.X.对序列进行分析比对,计算种内、种间遗传距离,同时使用该软件构建NJ系统发育树。结果 将测序结果录入Genbank中进行比对分析,结果显示单一DNA条形码序列无法有效区分虞美人与罂粟。通过Genbank下载数据使用matK+rbcL+trnH-psbA组合条形码构建系统发育树成功,对罂粟和虞美人样本测序结果进行验证。经验证,matK+rbcL+trnH-psbA组合条形码构建NJ发育树成功,能有效区分虞美人和罂粟。结论 matK+rbcL+trnH-psbA作为组合DNA条形码使用,可以有效鉴别罂粟属内植物。

Emergence of Plastidial Intergenic Spacers as Suitable DNA Barcodes for Arid Medicinal Plant <i>Rhazya stricta</i>

The desert plant Rhazya stricta has anticancer and antimicrobial properties, and is widely used in indigenous medicines of Saudi Arabia. However, the therapeutic benefits rely on an accurate identification of this species. The authenticity of R. stricta and other medicinal plants and herbs procured from local markets can be questionable due to a lack of clear phenotypic traits. DNA barcoding is an emerging technology for rapid and accurate species identification. In this study, six candidate chloroplastid barcodes were investigated for the authentication of R. stricta. We compared the DNA sequences from fifty locally collected and five market samples of R. stricta with database sequences of R. stricta and seven closely related species. We found that the coding regions matK, rbcL, rpoB, and rpoC1 were highly similar among the taxa. By contrast, the intergenic spacers psbK-psbI and atpF-atpH were variable loci distinct for the medicinal plant R. stricta. psbK-psbI clearly discriminated R. stricta samples as an efficient single locus marker, whereas a two-locus marker combination comprising psbK-psbI + atpF-atpH was also promising according to results from the Basic Local Alignment Search Tool and a maximum likelihood gene tree generated using PHyML. Two-dimensional DNA barcodes (i.e., QR codes) for the psbK-psbI and psbK-psbI + atpF-atpH regions were created for the validation of fresh or dried R. stricta samples.

植物DNA条形码技术

DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统,从而实现对物种的快速自动鉴定。尽管这一技术在理论上和具体应用上仍存在很多争论,但DNA条形码概念自2003年由加拿大分类学家Paul Hebert首次提出后就在世界范围内受到了广泛关注。在植物类群中条形码的研究和应用尚处于探索阶段,稍落后于对动物类群的研究,这主要表现在:(1)DNA条形码的选择及其评价仍没有统一的标准;(2)对类群较全面的形态分类学修订和植物DNA条形码研究的结合十分缺乏;(3)以往研究在取样上尺度较大,而对具体类群的研究较少,一个科或一个属只用有限的种类作为代表,同一种内的取样个体数量也不足,这样虽然表面上看来利用选定的DNA条形码可以较容易地把代表物种区分开,但实际上目前建议的植物DNA条形码(例如由生命条形码咨询委员会植物工作组最近提出的rbcL和matK)由于其分子进化速率较慢,在种级水平上,特别是对于那些经历了适应辐射或快速进化的属来说,分辨率较低。而DNA条形码的应用主要集中在属内物种水平的鉴别,因此只有针对具体类群进行探索研究,发现进化速率较快、分辨率高且通用性好的条形码,才可能为建立完整的条形码数据库起到积极有效的作用。

石斛属植物DNA条形码序列的筛选

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种新的物种鉴定技术,COI序列已成功应用于动物的鉴定,但目前国际上还没有找到一个通用序列能鉴定所有植物物种。为筛选出适合于石斛属的DNA条形码序列,本文首先应用Mega 4.0软件分析了石斛属的ITS、matK、trnH-psbA、rbcL序列的特征,然后运用Wilcoxon秩和检验比较不同序列的种内和种间变异性,运用Taxon DNA软件评估这4个序列的barcoding gap。分析结果表明:ITS序列不仅种内变异和种间变异最大,而且有明显的barcoding gap,种内变异和种间变异重合较少,能较好地区分不同种类的石斛,可考虑作为石斛属DNA barcoding鉴定候选序列之一;matK、trnH-psbA和rbcL序列都不适合于石斛属DNA barcoding鉴定。在所分析的4个候选序列中,没有任何一个单一序列能完全鉴别出不同种类的石斛属植物。建议采用不同序列组合进行石斛属DNA barcoding鉴定。

獐牙菜亚族植物DNA条形码研究

为准确鉴定獐牙菜亚族植物(包含常用藏药"蒂达"(藏茵陈))的基原植物,实现对贮藏药材的标准化鉴别.本研究利用核基因ITS片段和叶绿体rbcL、mat K和trnH-psbA片段对獐牙菜亚族25种50个个体进行DNA条形码研究,结合4个候选条形码及其组合的种内、种间距离分布及物种鉴别率评价其在獐牙菜亚族植物中的应用效果.结果表明:核基因ITS片段不仅在单片段中鉴别率最高(80%),包含ITS片段的候选条形码组合的物种鉴别率均为100%,考虑mat K+ITS组合对种子植物的物种鉴别效果更好,推荐双条形码组合mat K+ITS为獐牙菜亚族植物的标准条形码.

荨麻科植物DNA条形码的筛选

【目的】评价不同DNA条形码候选序列对荨麻科植物的鉴别能力,为荨麻科植物鉴定提供参考。【方法】使用ITS、matK、rbcL和psbA-trnH序列的通用引物对荨麻科植物进行PCR扩增和测序,比较各序列的扩增效率、测序成功率,分析获得序列的碱基组成及变异,比较种间和种内变异的差异,并对条形码间距进行评估。【结果】psbA-trnH序列在荨麻科植物13个种30个样品中的扩增成功率最高（100.0%）。psbA-trnH的有效序列获得率最高,为95.4%,ITS为92.3%,rbcL为90.1%,matK为零。ITS序列种间遗传距离范围为0~0.508,psbA-trnH序列为0~0.522,rbcL序列为0~0.532。ITS序列在种间、种内的差异变异及条形码间距较rbcL与psbA-trnH具有更明显的优势。ITS序列构建的系统发育树中不同物种形成单系分支的百分比最高,其次为psbA-trnH、rbcL序列。聚类结果表明,MP法的聚类效果最好,其次为UPGMA法、ML法,NJ法最不理想。【结论】荨麻科植物种间变异明显大于种内变异,DNA条形码适用于荨麻科植物种水平上的鉴定;3个候选序列中无任何一个序列可完全鉴别出不同种类的荨麻科植物,ITS、rbcL与psbA-trnH可作为鉴别荨麻科植物的DNA条形码序列组合。

胡椒属植物DNA条形码初步研究

为筛选胡椒属DNA条形码最佳片段,研究了ITS、rbcL、psbJ-petA和matK基因片段的有效使用性、种内种间变异和barcoding gap,并评估了序列鉴定效率。结果显示:ITS和matK的barcoding gap图相对较好,matK物种水平鉴定成功率高,ITS种间变异较大,而其他2个候选序列不能进行有效鉴定。为此,推荐matK和ITS作为胡椒属植物潜在的DNA条形码序列,并依此探索建立该属的DNA条形码鉴定方法。

禾本科8种牧草DNA条形码通用序列筛选

DNA条形码技术是利用DNA保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。本研究根据GenBank中禾本科牧草matK和rbcL基因的核苷酸序列,设计4对通用引物,建立并优化了针对禾本科7个主要牧草属8种牧草11个样品[高丹草（Sorghum bicolor×S.sudanense）、玉米（Zea mays）、针茅（Stipa capillata）、＂贝克＂多年生黑麦草（Lolium perenne‘Plxie）、＂凯帝莎＂多年生黑麦草（L.perenne‘Caddieshack’）、甘肃羊茅（Festuca kansuensis）、＂百琪＂紫羊茅（F.rubra‘Bargena’）、＂梦神＂紫羊茅（F.rubra‘Maxima’）、＂百胜＂草地早熟禾（Poa pratensis‘Barvictor’）、＂钻石＂草地早熟禾（P.pratensis‘Diamond’）和芨芨草（Achnatherum splendens）]的目的片段的扩增条件。对扩增产物进行测序和分析,经分别比对,筛选出8种牧草的4个标记位点5’端和3’端保守序列。对各标记位点保守区内的核苷酸进行单核苷酸多态性（SNPs）的单倍型分析。结果表明,matK1、matK2、matK3分别有6个单倍型（H1^A、H1^B、H1^C、H1^D、H1^E和H1^F）、7个单倍型（H2^A、H2^B、H2^C、H2^D、H2^E、H2^F和H2^G）和3个单倍型（H3^A、H3^B和H3^C）,rbcL基因有5个单倍型（H4^A、H4^B、H4^C、H4^D和H4^E）。根据matK（matK1、matK2、matK3）和rbcL基因筛选的4个标记位点为8种牧草建立了相对应的特异DNA识别码。本研究可为混合禾本科牧草饲料中的高粱属、玉蜀黍属、芨芨草属、针茅属、黑麦草属、羊茅属和早熟禾属的8种牧草准确识别提供分子水平上的科学依据。

落葵薯DNA条形码筛选及其近缘植物的分子鉴定

目的:利用DNA条形码鉴定落葵薯及其近缘植物。方法:对来自不同产地的28份落葵薯及其近缘植物的核基因ITS序列和ITS2序列、叶绿体基因matK序列、psbA-trnH序列和rbcL序列进行PCR扩增并测序,比较不同序列的PCR成功率及测序成功率,对各序列进行种内和种间变异分析,Barcoding gap检验,以及构建NJ树聚类分析,评估不同序列对落葵薯及其近缘植物的鉴别能力。结果:经PCR扩增、测序后发现落葵psbA-trnH序列出现碱基缺失事件,其他序列均扩增、测序成功;matK序列和rbcL序列的测序成功率均为100%,ITS序列和ITS2序列的测序成功率分别为78.75%和64.28%;4条序列中,ITS序列和matK序列的种内和种间距离分别在barcoding gap检验中明显分离;从NJ树来看,ITS序列、matK序列均可区分落葵薯及其近缘植物。结论:建议采用ITS序列及matK序列作为落葵薯及其近缘植物鉴定的DNA条形码。

DNA条形码在黄精属药用植物鉴定与遗传多样性分析中的应用

黄精属(Polygonatum)的许多物种具有重要的药用价值,但目前缺乏能够准确、高效地鉴定黄精属药用植物的DNA条形码。本研究通过对ITS、trnK-matK、rbcL、psbA-trnH和psbK-psbI序列进行扩增和测序,并从ITS序列中提取ITS2序列,共获得黄精属7个药用物种23份样品的138条序列。进一步比较6个DNA条形码对黄精属药用植物的鉴定效率,并验证所筛选条形码的可靠性。结果显示:trnK-matK的种内和种间变异重合少且有较明显的条形码间隙,其他5个序列的种内和种间变异重合多且无条形码间隙;BLAST结果表明trnK-matK的鉴定效率最高(85.7%),系统发育树显示trnK-matK的鉴定能力最强,能将全部12个多花黄精样品聚在一支,并能区分黄精、滇黄精、玉竹、点花黄精和湖北黄精;AMOVA分析结果揭示trnK-matK的群体遗传分化指数(F_(st))最高,适用于区分黄精属物种间差异。因此,trnK-matK最适用于黄精属药用植物的分子鉴定。

基于matK和rbcLDNA序列条形码鉴定柑橘及其近缘属植物

对柑橘及其近缘属植物59份样品进行叶绿体matK和rbcL的序列测定,序列比对与人工校正,计算属间、种间以及种内的遗传距离,比较序列间的差异,构建系统发育树。结果表明,matK、rbcL及其组合(matK+rbcL)可以对柑橘及其近缘属属间进行鉴定,在种间水平上三者的鉴定率分别为55.9%、37.3%和83.0%。由此可见,与单一片段相比,matK+rbcL序列组合鉴定率更高,可用于对柑橘及其近缘属植物进行物种鉴定。

黔产9种薯蓣属植物分子鉴别及亲缘关系研究

为揭示黔产薯蓣属植物9个种之间的亲缘关系,根据叶绿体mat K、rbc L、psb A-trn H序列片段对其进行种间分子鉴别研究。结果表明,黔产薯蓣属植物9个种的mat K、psb A-trn H、rbc L序列长度分别为1 076~1 144 bp、361~382 bp、1 160~1 209 bp,当空位始终做缺失处理时,其变异位点分别占序列总长度的14.3%、7.8%及8.7%。系统进化分析显示,来自9个种31份样本的薯蓣属植物分为了4个大组。其中,黄独单独为一组,为基生翅组;黑珠芽薯蓣和高山薯蓣聚为一组,为复叶组;光亮薯蓣和毛胶薯蓣聚为一组,为顶生翅组;光叶薯蓣、薯莨、日本薯蓣以及薯蓣聚为一组,为周生翅组。表明mat K、rbc L、psb A-trn H序列片段对薯蓣属植物的系统分类具有明显的指导价值。

忍冬科药用植物DNA条形码通用序列的筛选

目的:从4条DNA片段(psbA-trnH,matK,rbcL,和ITS2)中筛选可用于忍冬科药用植物鉴定的DNA条形码通用序列。方法:通过比较各序列的PCR扩增成功率、测序效率、种内和种间变异、barcoding gap和鉴定成功率等指标评价不同序列在忍冬科植物中的鉴定能力。结果:对忍冬科13个属,33个物种,58个样本进行分析,ITS2序列在属水平上的鉴定成功率为100.0%,物种水平上的鉴定成功率为96.6%。结论:ITS2序列可以作为忍冬科植物的DNA条形码候选序列,同时推荐psbA-trnH序列作为ITS2序列的补充序列。

葫芦科植物通用DNA条形码的筛选

目的评价几个热点DNA条形码候选序列对葫芦科植物的鉴别能力。方法使用ITS2、rbcL、matK和psbA-trnH序列的通用引物对葫芦科植物进行PCR扩增和测序,通过比较各序列的扩增和测序成功率、种内和种间的变异、barcodinggap,并采取相似性探索BLAST 1和最近距离Nearest Distance方法评价不同序列的鉴别能力。结果 ITS2序列对葫芦科33个属、90个物种、182个样本进行分析,其鉴定成功率较高,在属水平为100.0%,在物种水平为88.5%;psbA-trnH序列对201个样本进行分析,其鉴定成功率在属水平为93.0%,在物种水平为73.1%,但其可以补充部分ITS2不能分析的物种区域。结论 ITS2和psbA-trnH是适合葫芦科植物鉴别的一个较好的DNA条形码序列组合。

泽泻科植物DNA条形码的筛选研究

目的:筛选出适合于泽泻科植物的DNA条形码。方法:采用MEGA 5.1软件分析泽泻科植物核内转录间隔区(ITS2)、核酮糖-1,5-二磷酸化/加氧酶大亚基编码基因(rbcL)、成熟酶K编码基因(matK)序列信息并比较不同序列种间、种内变异大小。采用Wilcoxon检验对计算结果进行检验,通过比较序列种内和种间变异的分布评估条形码间距(barcoding gap)。采用MEGA 5.1软件构建聚类树,评价不同候选序列的鉴定有效性。结果:分别获得ITS2、rbcL、matK序列42、46、27条,长度和GC含量范围为259-731bp和32.7%-60.1%。ITS2序列种内和种间变异均最大,而且种内变异和种间变异重合较少,有较明显的barcoding gap,形成单系分支百分比可达69.23%,能较好地区分泽泻科植物;rbcL、matK种内变异和种间变异重叠度高,鉴定效率均比ITS2低;3条候选序列均不能单独鉴别所有泽泻科物种。基于ITS2序列的聚类树揭示了泽泻属与其他3个属的亲缘关系较远。结论:建议采用多位点组合条形码进行泽泻科的鉴别。

茜草及其混伪品DNA条形码鉴定

目的正确鉴别中药材茜草及其混伪品。方法本实验对茜草及其混伪品共13个物种的psbA-trnH、matK和rbcL共317条序列进行分析，建立DNA条形码鉴定体系。采用MEGA5．1进行种内种间变异及K2P（Kimura-2-Parameter）遗传距离分析，并构建NJ系统聚类树，评价psbA-trnH、marK和rbcL序列及其组合对茜草与混伪品的鉴定能力。结果76份基原植物样品的DNA均能成功提取。psbA-trnH、matK和r6cJ已序列扩增成功率分别为100％、96％和99％。psbA-trnH、matK和r6吐单个序列及其两两组合，能将茜草与不同属的混伪品成功区分，但对同属其他物种鉴定效果不理想。psbA-trnH＋matK＋rbcL组合序列鉴定效果最好，种内K2P遗传距离为0～0．0014，种间K2P遗传距离0．0007～0．6303；NJ树显示茜草能与其混伪品茜草属其他8个物种以及紫金牛、丹参、川赤芍、蓬子菜明显区分。市场购买的30份未鉴定的茜草药材中，22份样品能成功扩增3个基因片段，采用NJ树分析，其中11份样品与茜草聚为一支，剩余样品聚为单独3支，为茜草属其他物种。结论psbA—trnH＋marK＋rbcJ已组合序列能作为DNA条形码对茜草及其混伪品进行鉴定。

基于DNA条形码分析的霍山石斛及其常见混伪品的初步研究

该研究选择叶绿体基因rbcL,matK及核基因组ITS2序列初步探讨石斛属植物的系统发育关系,筛选可用于石斛属药用植物鉴定的DNA条形码通用序列,分析应用DNA条形码对霍山石斛及伪品进行品种鉴定的可能性。使用ITS2,rbcL,matK序列的通用引物对石斛属植物进行扩增测序,通过比较各序列的扩增和测序成功率,种内和种间的变异等指标,运用Bio Edit,MEGA 5. 0等软件分析序列,构建NJ分子系统树,进而评价不同序列的鉴定能力。结果表明ITS2序列不仅在石斛属种内变异和种间变异最大,而且有明显的条形码间隙,种内变异和种间变异重合较少,ITS2序列不同石斛种形成单系分支的百分比也最高,能较好地区分不同种类的石斛。rbcL和matK序列扩增成功率低、NJ系统树可靠性不高,rbcL和matK序列构建的系统树中形成单系的物种支持百分比例均较低。因此ITS2序列可以作为DNA条形码用来鉴别霍山石斛和铜皮石斛、铁皮石斛。

DNA条形码在中国金合欢属中的应用

根据形态特征难以准确地辨别金合欢属植物,DNA条形码技术提供了一种准确地鉴定物种的方法。本文利用条形码技术对中国金合欢属物种的序列(psbA-trnH、matK、rbcL和ITS)及其不同组合进行比较,通过计算种内和种间变异进行barcoding gap分析,运用Wilcoxon秩和检验比较不同序列的变异性,构建系统树。结果表明:4个片段均存在barcoding gap,ITS序列种间变异率较psbA-trnH、rbcL和matK序列有明显优势,单片段ITS正确鉴定率最高,ITS+rbcL片段联合条码的正确鉴定率最高,因此我们认为ITS片段或条形码组合ITS+rbcL是金合欢属的快速鉴别最理想的条码。

中国秋海棠属(秋海棠科)植物的DNA条形码评价

秋海棠属植物种类繁多,形态变异多样,导致种类的系统放置混乱,近缘种类鉴定困难。利用DNA条形码实现物种快速准确的鉴定技术具有不受形态特征约束的优势,为秋海棠属植物的分类鉴定提供了新的方法。本研究选择4个DNA条形码候选片段(rbcL,matK,trnH-psbA,ITS)对中国秋海棠属26种136个个体进行了分析。结果显示:叶绿体基因rbcL,matK和trnH-psbA种内和种间变异小,对秋海棠属植物的鉴别能力有限;ITS/ITS2种内和种间变异大,在本研究中物种正确鉴定率达到100%/96%,可考虑作为秋海棠属DNA条形码鉴定的候选片段。研究结果支持中国植物条形码研究组建议将核基因ITS/ITS2纳入种子植物DNA条形码核心片段中的观点。

剑麻种质资源DNA条形码遗传多样性分析

剑麻是重要的国防和工业战略物资,准确和快速鉴别剑麻种质对于剑麻品种选育具有重要意义。本研究对82份剑麻种质资源中的rbcL和matK的DNA条形码编码区进行测序,分析了rbcL和matK的NJ聚类图、条形码序列多样性以及碱基替换概率。结果显示,rbcL序列GC含量为42.97%,matK序列GC含量为30.55%;matK DNA条形码差异位点数和位点变异率明显高于rbcL DNA;NJ聚类图显示,rbcL序列可将82个剑麻种质分为6个亚群,而matK序列可将82个剑麻种质分为8个亚群,群内每种剑麻种质与其他种质之间均存在一定的遗传距离;差异位点数、位点变异率、核苷酸多样性、中性检验统计等序列多样性结果表明,matK序列的差异性明显高于rbcL序列;rbcL序列和matK序列的碱基发生了不同程度的转换和颠换,碱基转换主要发生在T与C之间,而C和G碱基之间比较保守,发生的颠换概率最低。综上所述,matK序列在剑麻种质中遗传多样性更高,更适用于剑麻种质鉴别。