胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4水平表达及其与临床病理特征和预后的关系

目的研究胶质瘤组织中甲状腺激素受体结合蛋白4(thyroid hormone receptor interacting protein 4,TRIP4)和DNA损伤诱导转录因子4(DNA damage inducing transcription factor 4,DDIT4)水平表达及其与临床病理特征和预后的关系。方法选取2018年2月~2019年2月河北医科大学第一医院收治的94例胶质瘤患者为研究对象。应用免疫组织化学法检测组织中TRIP4和DDIT4蛋白表达。比较不同临床病理特征脑胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4蛋白表达。采用Kaplan-Meier生存曲线分析不同TRIP4和DDIT4蛋白表达胶质瘤患者生存预后的差异。单因素和多因素COX回归分析影响胶质瘤患者生存预后的因素。结果胶质瘤组织中TRIP4(68.09%)和DDIT4(65.96%)蛋白阳性率高于瘤旁组织(13.83%,10.64%),差异具有统计学意义(χ^(2)=57.212,60.866,均P<0.05)。胶质瘤组织中TRIP4与DDIT4蛋白表达呈显著正相关性(r=0.722,P<0.05)。WHO分级Ⅲ级、肿瘤直径≥3cm胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4蛋白阳性率均高于WHO分级Ⅰ~Ⅱ级、肿瘤直径<3cm胶质瘤组织,差异具有统计学意义(χ^(2)=6.393~14.754,均P<0.05)。TRIP4阳性表达组和阴性表达组三年总体生存率分别为37.50%(24/64),66.67%(20/30),TRIP4阳性表达组三年累积生存率低于阴性表达组,差异具有统计学意义(Log-rankχ^(2)=5.949,P=0.015)。DDIT4阳性表达组和阴性表达组三年总体生存率分别为37.10%(23/62),70.00%(21/30),DDIT4阳性表达组三年累积生存率低于阴性表达组,差异具有统计学意义(Log-rankχ^(2)=7.642,P=0.006)。肿瘤直径≥3cm(HR=1.614,P=0.000),WHO分级Ⅲ级(HR=1.790,P=0.000),TRIP4阳性表达(HR=1.665,P=0.000),DDIT4阳性表达(HR=1.476,P=0.000)是影响胶质瘤患者生存预后的独立危险因素。结论胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4蛋白表达升高,两者与肿瘤直径及WHO分级相关,是潜在的评估胶质瘤预后的肿瘤标志物。

血清PKN1、TNFRSF4、DDIT4预测子宫内膜癌患者淋巴结转移及预后的临床价值

目的探讨血清蛋白激酶N1(PKN1)、肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)、DNA损伤诱导转录因子4(DDIT4)预测子宫内膜癌患者淋巴结转移和预后的临床价值。方法选取2019年10月至2021年10月于唐山市妇幼保健院治疗的180例子宫内膜癌患者为子宫内膜癌组。另选取同期在该院治疗的子宫良性疾病患者180例作为良性疾病组,以及在该院体检的180例健康者作为健康组。子宫内膜癌组根据是否发生淋巴结转移分为淋巴结转移组42例和无淋巴结转移组138例,按照随访结果将患者分为预后不良组和预后良好组。比较各组血清PKN1、TNFRSF4、DDIT4水平,Logistic模型分析患者预后的影响因素,以及绘制受试者工作特征曲线分析血清PKN1、TNFRSF4、DDIT4对患者预后的预测价值。结果与健康组比较,子宫内膜癌组、良性疾病组血清PKN1、DDIT4水平升高,血清TNFRSF4水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。淋巴结转移组血清PKN1、DDIT4水平高于无淋巴结转移组,TNFRSF4水平低于无淋巴结转移组,差异有统计学意义(P<0.05)。预后不良组低分化程度、淋巴脉管间隙浸润阳性、肌层浸润≥1/2的占比高于预后良好组,差异有统计学意义(P<0.05)。预后不良组血清PKN1、DDIT4水平高于预后良好组,TNFRSF4水平低于预后良好组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清PKN1、DDIT4、LVSI、肌层浸润是子宫内膜癌预后的危险因素,血清TNFRSF4为子宫内膜癌预后的保护因素(P<0.05)。血清PKN1、TNFRSF4、DDIT4联合对子宫内膜癌患者预后状况的预测效能高于各血清指标单独预测(P<0.05)。结论血清PKN1、TNFRSF4、DDIT4与子宫内膜癌患者淋巴结转移及预后有关,且对患者预后的预测效能较高。

circMAN1A2调节miR-212-3p/DDIT4轴对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的探究circMAN1A2靶向miR-212-3p/DNA损伤诱导转录子4(NDA damage-inducible transcript 4,DDIT4)轴对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法qRT-PCR法检测胃癌组织和细胞中circMAN1A2、miR-212-3p表达水平。荧光素酶检测circMAN1A2与miR-212-3p、DDIT4和miR-212-3p的靶向关系。在胃癌细胞SGC-7901、HGC-27中转染si-NC、si-circMAN1A2、si-circMAN1A2+anti-NC、si-circMAN1A2+anti-miR-212-3p、miR-NC、miR-212-3p mimics,将未转染的SGC-7901、HGC-27细胞设为对照。平板克隆实验检测细胞增殖;细胞划痕及Transwell实验分别检测细胞迁移、侵袭能力。Western blotting检测增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达。结果在胃癌组织及细胞中,circMAN1A2高表达,miR-212-3p低表达;下调circMAN1A2可以靶向上调miR-212-3p表达,且下调DDIT4表达,进而抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。抑制miR-212-3p表达可部分逆转抑制circMAN1A2表达对胃癌细胞恶性增殖的抑制作用。结论在胃癌细胞中抑制circMAN1A2表达可抑制胃癌细胞增殖、迁移与侵袭,其与调节miR-212-3p/DDIT4信号轴有关。

DDIT4通过自噬相关通路影响大肠癌的发生研究

目的观察DNA损伤诱导转录物4(DDIT4)在大肠癌(CRC)组织和癌旁组织中的表达,探索其与临床病理特征的相关性、预后及作用机制。方法从癌症基因组图谱(TCGA)数据库收集CRC数据集,比较DDIT4mRNA的表达及预后相关性分析,筛选关键基因进行功能富集分析。收集2022年5月至2023年5月在温州医科大学黄岩医院诊断为CRC的石蜡标本观察组100例,对照组60例,通过免疫组化染色检测肿瘤和癌旁DDIT4的表达,并进行临床病理特征的相关性分析。培养CRC及正常肠上皮细胞系,RT-PCR检测其DDIT4 mRNA的表达,基因干预DDIT4的表达,Western blot法检测自噬通路相关蛋白(mTOR、p-mTOR、Beclin1、P62)的表达。结果TCGA数据库数据和免疫组化结果显示DDIT4在CRC中表达显著增加(P<0.001),与患者总体生存率、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移、DUKES分期和血清CEA水平相关(P<0.05)。沉默DDIT4基因,mTOR自噬相关通路下游p-mTOR/mTOR比值及P62相对升高,Beclin1相对降低(P<0.05)。结论DDIT4基因与CRC的发生发展及不良预后显著相关,其机制可能与DDIT4参与调控mTOR信号通路激活自噬有关。

DDIT4介导的自噬在毛乳头细胞氧化应激损伤中的保护作用

目的探索DNA损伤诱导转录因子4(DNA damage induced transcription factor 4,DDIT4)在毛乳头细胞氧化应激损伤中的保护作用及其机制。方法使用长波紫外线(ultraviolet radiation A,UVA)和过氧化氢(H 2 O 2)建立毛乳头细胞氧化应激模型;CCK-8检测不同处理条件下的细胞活力,利用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)试剂检测细胞内活性氧(ROS)的变化;电镜观察自噬小体;Western blot观察DDIT4及自噬相关指标微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、泛素结合蛋白(ubiquitin-binding protein P62,P62)、雷帕霉素哺乳动物靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p-mTOR的表达情况。结果UVA和H 2 O 2导致毛乳头细胞内ROS升高,活力下降(P<0.05);氧化应激环境下毛乳头细胞内的DDIT4表达增加(P<0.05),而抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)可有效抑制此效应(P<0.05);UVA或H 2 O 2处理后毛乳头细胞内自噬水平升高,表现为自噬体数量增多,LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高(P<0.05),P62表达下降(P<0.05),3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)阻断自噬可观察到细胞活力进一步降低(P<0.05),细胞内ROS增多(P<0.05),反之,雷帕霉素(rapamycin,RAPA)可增加自噬水平提升氧化条件下毛乳头细胞活力,减少细胞内ROS生成(P<0.05);下调DDIT4表达可使氧化应激环境下毛乳头细胞自噬减弱,LC3Ⅱ/Ⅰ减少(P<0.05),p-mTOR/mTOR、P62增加(P<0.05),细胞活力下降(P<0.05),细胞内ROS增多(P<0.05)。结论DDIT4可能通过自噬缓解毛乳头细胞氧化应激损伤。

LncRNA SNHG15通过miR-483-3p/DDIT4轴调节非小细胞肺癌细胞的顺铂敏感性和上皮间质转化

目的 探究LncRNA SNHG15对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的顺铂(DDP)敏感性和上皮间质转化的影响以及miR-483-3p/DNA损伤诱导转录物4(DDIT4)轴在其中发挥的作用。方法 体外培养NSCLC细胞(A549)、NSCLC耐药细胞(A549/DDP),检测两种细胞对DDP的IC50及LncRNA SNHG15、miR-483-3p、DDIT4 mRNA与蛋白表达,将A549/DDP细胞随机分为A549/DDP组、si NC组、si SNHG15组、si SNHG15+inhibitor NC组、si SNHG15+miR-483-3p inhibitor组、si SNHG15+miR-483-3p inhibitor+si NC组、si SNHG15+miR-483-3p inhibitor+si DDIT4组;蛋白印迹分析法检测各组细胞E-cad、N-cad、DDIT4蛋白表达变化;双荧光素酶报告实验验证miR-483-3p与LncRNA SNHG15、DDIT4的靶向关系。结果 与A549细胞相比,A549/DDP细胞对DDP的IC50、LncRNA SNHG15、DDIT4 mRNA与蛋白升高,miR-483-3p水平降低(P <0.05);A549/DDP组细胞间黏附明显被破坏;si SNHG15组、si SNHG15+miR-483-3p inhibitor+si DDIT4组细胞排列相对紧密,呈现上皮细胞特性;si SNHG15+miR-483-3p inhibitor组较si SNHG15组细胞排列松散、扩散细胞多;与A549/DDP组相比,si SNHG15组A549/DDP细胞增殖抑制率、E-cad表达升高,侵袭细胞数、迁移细胞数、N-cad、DDIT4表达降低(P <0.05);与si SNHG15组相比,si SNHG15+miR-483-3p inhibitor组A549/DDP细胞增殖抑制率、E-cad表达降低,侵袭细胞数、迁移细胞数、N-cad、DDIT4表达升高(P <0.05)。结论沉默A549/DDP细胞中SNHG15表达可通过调控miR-483-3p/DDIT4,抑制A549/DDP细胞增殖、侵袭、迁移、EMT,并降低A549/DDP细胞对DDP的耐药性。

miR-22通过靶向抑制DDIT4促进糖尿病肾病肾小管上皮细胞DNA损伤

目的:探究在糖尿病肾病(DKD)中微小RNA-22(miR-22)是否能靶向抑制DNA损伤诱导转录物4(DDIT4)的表达,进而通过毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(ATM)-细胞周期检查点激酶2(Chk2)通路促进DNA损伤。方法:(1)C57BL小鼠建立糖尿病(DM)模型,于16周后处死,分析其生化指标并对肾脏组织做HE染色,Western blot检测肾脏组织中p-ATM、p-Chk2和DDIT4蛋白水平;(2)分别用高糖(30 mmol/L葡萄糖)和正常糖(5.5 mmol/L葡萄糖)培养基培养大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,彗星实验检测DNA双链断裂程度,流式细胞术检测高糖对细胞周期的影响,Western blot检测细胞中p-ATM、p-Chk2和DDIT4蛋白水平;(3)构建DDIT4过表达质粒,转染NRK-52E细胞后通过彗星实验检测DDIT4过表达对DNA双链断裂的影响,并构建miR-22模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor),分别转染miR-22 mimics和inhibitor,通过Western blot检测细胞中p-ATM、p-Chk2和DDIT4蛋白水平。结果:(1)DM组小鼠肾组织中p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著增高,DDIT4蛋白水平显著下降(P<0.05)。(2)高糖培养的NRK-52E细胞比正常糖培养的细胞彗尾更长,p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著增高,DDIT4蛋白水平显著下降(P<0.05)。(3)高糖培养的NRK-52E细胞过表达DDIT4后,p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著降低,细胞彗尾变短;转染miR-22 mimics后,p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著增高,DDIT4蛋白水平显著下降;转染miR-22 inhibitor后,p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著下降,DDIT4蛋白水平显著增高(P<0.05)。结论:高糖可导致DNA损伤加重,其机制可能为miR-22靶向抑制DDIT4表达,诱导肾小管上皮细胞发生DNA损伤,从而促进DKD的发生发展。

多房棘球蚴囊液对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响

目的探讨多房棘球蚴囊液(Hydatid cyst fluid,HCF)对沉默DNA损伤诱导转录因子4(DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4)后小鼠肝细胞生物学功能的影响。方法1.采用免疫蛋白印迹法(Western Blot)、实时荧光定量法(RT-qPCR)检测经HCF处理的小鼠肝细胞中DDIT4蛋白的表达量,以检测转染效率;2.选用慢病毒转染小鼠正常肝细胞DDIT4后做HCF处理,采用细胞计数试剂8法(CCK-8)检测各组小鼠肝细胞的细胞活性;3.用Western Blot法检测Beclin-1、Caspase-3、LC3等凋亡自噬相关蛋白水平;4.用透射电镜观察HCF对小鼠肝细胞超微结构的影响。结果1.经HCF作用后慢病毒转染小鼠肝细胞的DDIT4基因及蛋白表达水平检测结果显示,LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3组分别与LV-Ddit4-NC组比较,前三组DDIT4蛋白含量显著下降,LV-Ddit4-RNAi 3组尤为显著(P<0.01)。2.LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL组细胞OD值明显大于LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL组(P<0.01);与HCF共培养48 h后,沉默DDIT4组细胞形态接近正常AML-12细胞的形态,多呈椭圆形或者圆形,且细胞生长密度较LV-Ddit4-NC组明显为高。3.与LV-Ddit4-NC con组比较,LV-Ddit4-NC 0.4 mg/mL HCF组和LV-Ddit4-NC 0.8 mg/mL HCF组的LC3-II、Beclin-1、Caspase-3蛋白表达水平显著增高(P<0.01);分别与LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL HCF组比较,LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL HCF组的LC3-II、Beclin-1、Caspase-3蛋白表达水平显著降低,均具有统计学意义。4.两对照组细胞胞质未见明显损伤,线粒体基质较均匀,粗面内质网未见明显扩张,自噬水平低;LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL组细胞损伤较轻,未见粗面内质网扩张,胞质内存在较多脂滴,自噬数量增多;LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL组细胞损伤严重,粗面内质网严重扩张,胞质内存在大量脂滴,可见大量自噬结构。结论HCF对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响:1.AML-12细胞增殖;2.AML-12细胞凋亡、自噬数量减少。

DDIT4对脑缺血再灌注损伤中自噬的调控作用

脑卒中（stroke）是危害人类健康与生命的常见病和多发病,是造成我国居民死亡的首位原因^（[1]）,其中缺血性脑卒中（ischemia stroke）的发病率及致死致残率更是居高不下,约占全部脑血管病的60%～80%。

DNA损伤诱导转录因子4过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制HT-22细胞增殖并促进其凋亡

神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一种由细胞增殖凋亡紊乱引起的先天缺陷性疾病。本室前期利用RNA-Seq技术,发现小鼠神经管畸形胚胎脑组织中DNA损伤诱导转录因子-4(DNA damage-inducible transcript 4,Ddit4)表达水平增加,但其在神经管畸形中的作用尚不清楚。本文拟探索Ddit4过表达对海马神经元HT-22细胞增殖和凋亡的影响及相关机制,从而为后续研究Ddit4在小鼠神经管畸形中的作用奠定基础。本研究首先根据小鼠Ddit4序列构建真核表达载体pEX-3-Ddit4,限制性酶切分析和测序结果表明pEX-3-Ddit4构建成功。qRT-PCR和Western印迹检测显示转染pEX-3-Ddit4后,HT-22细胞中DDIT4的表达水平明显增加(P<0.01)。CCK-8和Western印迹结果显示,Ddit4过表达导致HT-22细胞增殖下降(P<0.01)。流式细胞仪结果显示,转染pEX-3-Ddit4后,G0/G1期细胞比例增加、S期比例下降(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.05)。Western印迹检测发现,转染pEX-3-Ddit4能够显著上调切割胱天蛋白酶3(cleaved caspase3)水平(P<0.05),表明Ddit4过表达促进HT-22细胞凋亡。细胞免疫荧光及Western印迹结果显示,过表达Ddit4显著降低细胞β-联蛋白(β-catenin)、T细胞因子4、细胞周期蛋白D1和C-myc的表达水平(P<0.05),核内β-联蛋白减少,提示Ddit4过表达抑制了Wnt/β-catenin信号通路。过表达Ddit4的同时加入Wnt/β-catenin信号通路激动剂LiCl处理细胞可逆转上述现象,表明Ddit4过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路对HT-22细胞发挥抗增殖和促凋亡作用。

DDIT4在皮肤基底细胞癌中的表达及对细胞增殖和自噬通路的调控

目的:检测DNA损伤诱导转录因子-4(DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4)在皮肤基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)中的表达及其对下游的细胞蛋白合成、增殖和自噬水平的影响。方法:采用免疫组化和Western blot分别对15例人皮肤BCC组织和正常皮肤15例进行检测,比较两者DDIT4、p S6K1、p4E-BP1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达。结果:与正常组织相比,DDIT4(0.247±0.152,P=0.005)在BCC中的表达被明显抑制,伴p4E-BP1表达(0.290±0.169,P=0.015)和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(0.692±0.154,P=0.007)降低,但p S6K1(0.837±0.050,P=0.000)表达明显增加,具有统计差异。结论:DDIT4在BCC中的表达受抑制,可能通过其下游的mTORC1通路进而促进癌细胞的蛋白合成和增殖能力,但自噬流受阻,参与BCC的发生发展过程;DDIT4及其下游通路信号可能作为BCC的进一步治疗及预后研究的靶点。

DNA损伤诱导转录子4基因在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨DNA损伤诱导转录子4(DNA damage inducible transcript 4,DDIT4)基因在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中的表达水平及其临床意义。方法:分别下载癌症和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的OSCC队列数据(n=362)及基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中的GSE42743数据集(n=103)。比较OSCC组和正常对照组中DDIT4的表达水平,并分析DDIT4与OSCC患者临床特征和预后的关系。此外,利用生物信息学方法寻找DDIT4可能参与的生物学功能。结果:DDIT4在OSCC组中的表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。在OSCC患者中,DDIT4的表达水平与肿瘤分期呈正相关(P<0.001),且OSCC高表达组的总生存率明显低于低表达组(Log-rank检验,P<0.01)。进一步行Cox回归分析,结果提示DDIT4高表达是OSCC患者预后不良的独立预测因素(P<0.05)。生物信息学分析表明,DDIT可能与低氧反应、糖酵解、雷帕霉素靶蛋白C1(mammalian target of rapamycin C1,mTORC1)信号通路、核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)介导的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)信号通路、G 2M检查点、p53信号通路等生物学功能有关。结论:DDIT4基因在OSCC患者中呈高表达状态,并且其表达水平与肿瘤分期有关。高表达DDIT4基因的OSCC患者预后不佳。因此,DDIT4可作为OSCC预后评估的一种标记物。

微小RNA-221-3p通过DDIT4抑制镉诱导的TM3细胞凋亡机制

目的探讨微小RNA(microRNA,miRNA)中的miR-221-3p靶向DNA损伤诱导转录本4(DNA-damage-inducible transcript 4,DDIT4)对镉诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响和机制。方法小鼠睾丸间质细胞(mouse testicular stromal cells,TM3)经不同浓度的镉(0、10、20、30和40μmol/L)染毒后,使用CCK-8检测细胞活性。提取镉染毒TM3细胞的总RNA,以差异倍数(fold change,FC)>1.2,P<0.05作为标准筛选显著差异表达miRNA。TM3细胞分为空白对照组、阴性对照组、镉染毒组(CdCl2,20μmol/L)和镉染毒+miR-221-3p模拟物组,其中对镉染毒+miR-221-3p模拟物组,先将miR-221-3p模拟物转染进TM3细胞,再联合镉染毒24 h。Hoechst染色检测细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡率,实时荧光定量PCR和Western blot免疫印迹法检测DDIT4表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-221-3p与DDIT4的结合,生物信息学分析DDIT4的功能及与细胞凋亡的关联,过表达miR-221-3p后观察B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)的表达水平。结果镉染毒可降低TM3细胞活性且存在剂量-效应关系。细胞形态学发现,与对照组相比,镉染毒组细胞皱缩、细胞核浓染,凋亡率升至19.66%±0.45%(P<0.01);与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组正常形态细胞增多,凋亡率降至13.76%±0.37%(P<0.05)。镉染毒组miR-221-3p表达水平下调(P<0.01),DDIT4表达水平上调(P<0.05)。生物信息学分析和双荧光素酶报告分析发现DDIT4为miR-221-3p的靶基因之一。与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组DDIT4表达水平下调(P<0.05),Bcl-2/BAX比值由0.54±0.03增加为0.71±0.04。结论miR-221-3p通过靶向DDIT4进而抑制镉诱导的TM3细胞凋亡。

子宫内膜癌患者血清miR-429、DDIT4表达水平及临床意义

目的探讨子宫内膜癌(EC)患者血清中微RNA-429(miR-429)、DNA损伤诱导转录本4(DDIT4)表达水平及临床意义。方法纳入2020年5月至2021年5月石家庄市中医院收治EC患者(124例)作为观察对象(EC组),根据患者3年生存情况,将其分为生存组(79例)与死亡组(45例),另选择同期到石家庄市中医院体检的门诊健康者(120例)作为对照组。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清miR-429表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清DDIT4表达水平;采用Pearson法进行相关性分析;利用Kaplan-Meier生存曲线分析miR-429和DDIT4与患者预后相关性;利用Cox回归模型分析EC患者预后影响因素。结果EC组血清中miR-429表达水平低于对照组(P<0.05),DDIT4表达水平高于对照组(P<0.05)。Pearson相关性显示miR-429、DDIT4表达呈负相关(P<0.05)。EC患者血清miR-429、DDIT4表达水平与淋巴结转移阳性、浸润程度≥1/2cm有关(P<0.05)。血清miR-429低表达患者生存率(36.67%)显著低于miR-429高表达患者(89.06%)(P<0.05),DDIT4高表达患者生存率(35.48%)显著低于DDIT4低表达患者(91.94%)(P<0.05)。肌壁浸润程度≥1/2 cm、淋巴结转移阳性、miR-429低表达、DDIT4高表达是EC患者预后死亡的影响因素(P<0.05)。结论子宫内膜癌患者血清miR-429低表达,DDIT4高表达,与EC患者预后密切相关。

八聚体结合转录因子4通过调节上皮-间质转化促进食管鳞状细胞癌进展和放疗抵抗

目的探讨八聚体结合转录因子4(Oct4)与食管鳞状细胞癌进展和放疗抵抗的具体作用和分子机制。方法利用基因表达谱数据动态分析(GEPIA)数据库,分析Oct4基因在不同类型肿瘤组织和对应癌旁正常组织中的表达差异。2013年1月至2022年5月在河南省胸科医院接受手术联合放疗治疗的196例食管鳞状细胞癌患者,收集其临床资料及手术切除组织标本,采用免疫组化法检测癌及癌旁组织中Oct4蛋白的表达。通过慢病毒包装系统构建上调和下调Oct4的食管鳞状细胞癌细胞系,采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,克隆形成实验检测细胞的放疗敏感性,免疫荧光实验检测DNA损伤水平,Western blot检测Oct4、人磷酸化组蛋白(γ-H2AX)、E-cadherin、N-cadherin、vimentin、锌指E盒结合同源盒1(ZEB1)的表达。结果GEPIA数据库资料分析显示,食管癌组织中Oct4 mRNA的表达水平高于其癌旁组织(P<0.05)。196例食管鳞状细胞癌患者的肿瘤组织中Oct4蛋白表达水平为78.35±1.42,高于癌旁组织(16.27±0.49,P<0.001)。Oct4高表达组患者的生存时间明显短于Oct4低表达组(中位生存时间分别为25.40和47.00个月;HR=1.68,P=0.022)。与对照组比较,Oct4上调组KYSE510细胞增殖能力增强(培养72 h,吸光度分别为1.73±0.19和1.35±0.10,P=0.007),迁移能力增强[培养24 h,细胞迁移率分别为(41.67±1.20)%和(23.67±1.86)%,P=0.001],放疗敏感性降低(辐射增敏比分别为0.69±0.06和1.00±0.02,P=0.010),放疗后γ-H2AX表达水平降低,ZEB1、vimentin和N-cadherin表达升高,E-cadherin表达下降;Oct4下调1组和Oct4下调2组KYSE150细胞增殖能力减弱(培养72 h,吸光度分别为2.51±0.17、2.38±0.16和3.33±0.07,均P<0.01),迁移能力下降[培养24 h,细胞迁移率分别为(13.33±0.88)%、(13.00±1.00)%和(40.33±2.03)%,均P<0.001],放疗敏感性增强(辐射增敏比分别为1.34±0.11、1.24±0.07和1.00±0.02,均P<0.05),放疗后γ-H2AX表达水平升高,ZEB1、vimentin和N-cadherin表达下降,E-cadherin表达升高。与对照组比较,ZEB1下调组KYSE510细胞增殖能力减弱(培养72 h,吸光度分别为1.33±0.15和1.81±0.16,P=0.002),放疗敏感性增强(辐射增敏比分别为1.37±0.11和1.00±0.01,P=0.037),放疗后γ-H2AX表达水平升高。结论Oct4参与调节食管鳞状细胞癌细胞上皮-间质转化,进而促进食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和放疗抵抗。

DDIT4对A549细胞增殖迁移的影响及其机制

目的探讨DNA损伤诱导转录因子4(DDIT4)在肺腺癌细胞中的表达及其对细胞增殖、凋亡的影响和可能机制。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹检测DDIT4在肺腺癌细胞系(H1299和A549)及正常肺支气管上皮细胞(BEAS-2B)中表达;慢病毒转染抑制A549细胞中DDIT4表达,分为DDIT4敲低慢病毒(sh-DDIT4,分为sh-DDIT4#1、sh-DDIT4#2和sh-DDIT4#3)组和转染空病毒(NC)组。蛋白质印迹检测细胞中DDIT4沉默效果;CCK-8、平板克隆形成实验检测sh-DDIT4对肺腺癌细胞增殖能力的影响;TUNEL凋亡实验检测sh-DDIT4对肺腺癌细胞凋亡能力的影响;Transwell和划痕实验检测sh-DDIT4对肺腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。结果qRT-PCR结果显示,DDIT4 mRNA在BEAS-2B、H1299和A549细胞中相对表达水平分别为1.01±0.04、2.19±0.09和3.10±0.09,差异有统计学意义,F=183.00,P<0.001。蛋白质印迹结果显示,DDIT4蛋白在BEAS-2B、H1299和A549中表达水平分别为0.39±0.02、0.98±0.01和1.00±0.02,差异有统计学意义,F=457.00,P<0.001。DDIT4mRNA在NC、sh-DDIT4#1、sh-DDIT4#2和sh-DDIT4#3组中表达量分别为1.01±0.02、0.58±0.02、0.59±0.02和0.27±0.04,差异有统计学意义,F=150.40,P<0.001;DDIT4蛋白在各组中表达量分别为1.12±0.01、0.61±0.02、0.62±0.02和0.23±0.05,差异有统计学意义,F=145.10,P<0.001。CCK-8增殖实验结果显示,120h时NC和sh-DDIT4组细胞生长率分别为0.91±0.04和0.57±0.01,差异有统计学意义,t=7.71,P<0.001。克隆形成实验结果显示,NC和sh-DDIT4组细胞克隆形成数量分别为120.70±6.64和10.67±0.88,差异有统计学意义,t=16.42,P<0.001。EdU实验结果显示,NC和sh-DDIT4组细胞的EdU阳性率分别为(64.33±1.76)%和(13.33±1.20)%,差异有统计学意义,t=23.89,P<0.001。细胞凋亡结果显示,NC和sh-DDIT4组细胞凋亡率分别为(22.33±1.45)%和(49.67±0.88)%,差异有统计学意义,t=16.08,P<0.001。细胞划痕实验结果显示,36h时NC和sh-DDIT4组细胞愈合度分别(84.33±1.86)%和(44.67±2.03)%,差异有统计学意义,t=14.43,P<0.001。Transwell侵袭实验结果显示,NC和sh-DDIT4组穿过小室的细胞数量分别为为(118.00±3.79)和(28.00±1.73)个,差异有统计学意义,t=21.62,P<0.001。结论DDIT4在肺腺癌细胞中表达上调,沉默DDIT4表达可抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭,诱导细胞凋亡。

敲低DDIT4通过ERK1/2通路抑制口腔鳞状细胞癌增殖和侵袭

目的:研究敲低DNA损伤诱导转录子4(DDIT4)通过细胞外信号调节激酶(ERK1/2)通路抑制口腔鳞状细胞癌(OSCC)增殖和侵袭。方法:培养OSCC细胞系CAL27、Tca8113、SCC9及人正常口腔黏膜细胞系HOK,检测DDIT4的表达水平。将Tca8113随机分为对照组、si-阴性对照(NC)组、si-DDIT4组、PD98059组,检测细胞增殖OD_(490 nm)值、侵袭数目及DDIT4、p-ERK1/2、Bcl-2、c-myc、MMP2、MMP9的表达水平。结果:CAL27、Tca8113、SCC9细胞中DDIT4的表达水平均高于HOK细胞(P<0.05),且Tca8113细胞中DDIT4的表达水平高于CAL27、SCC9细胞(P<0.05)。si-DDIT4组Tca8113细胞的OD_(490 nm)值、侵袭数目及DDIT4、p-ERK1/2、Bcl-2、c-myc、MMP2、MMP9的表达水平均低于对照组及si-NC组(P<0.05)。PD98059组Tca8113细胞的OD_(490 nm)值、侵袭数目及p-ERK1/2、Bcl-2、c-myc、MMP2、MMP9的表达水平均低于对照组(P<0.05)。结论:DDIT4通过ERK1/2通路参与OSCC的发病。

miR-7-5p抑制胰腺癌细胞放疗后加速再增殖的体外实验研究

目的研究放疗后濒死胰腺癌细胞(PANC-1)释放的微小RNA-7-5p(miR-7-5p)对存活PANC-1加速再增殖效应的相关机制。方法通过慢病毒感染,建立荧光素酶标记的PANC-1-LUC胰腺癌细胞放疗后加速再增殖模型。通过RT-qPCR检测miRNA-7-5p的表达水平,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,双荧光素酶法验证miR-7-5p靶基因,Western blotting检测γH2A.X与DDIT4蛋白的表达情况。结果miR-7-5p在受辐照PANC-1(10 Gy)濒死细胞上清中表达下调,受辐照PANC-1细胞与存活PANC-1-LUC细胞共培养,可促进放疗后存活PANC-1-LUC细胞加速再增殖及其DNA损伤修复,而上调miR-7-5p可抑制放疗后胰腺癌细胞PANC-1-LUC再增殖。进一步研究表明,miR-7-5p在胰腺癌细胞中通过靶向下调DDIT4通路促进凋亡信号。结论受辐照胰腺癌细胞可通过下调miR-7-5p促进DDIT4表达,从而抑制细胞凋亡及调控细胞周期再分布来加速再增殖,表明提高miR-7-5p的水平能够提高胰腺癌细胞的放疗敏感性,这将为改善胰腺癌放疗抵抗提供了一种新的思路和方法。

高通量数据分析DNA损伤诱导转录样蛋白4在脑多形性胶质母细胞瘤中表达及临床意义

目的探讨DNA损伤诱导转录样蛋白4(DDIT4L)在人脑多形性胶质母细胞瘤(GBM)中的表达与患者预后的关系及相关机制。方法分别从癌症基因组图谱(TCGA)和人类肿瘤相关基因表达汇编(GEO)数据库下载GBM的RNASeq V2数据,以及GBM样本数据集GSE7696的系列矩阵数据。应用Kaplan-Meier和多因素COX逐步回归分析方法确定DDIT4L的预后价值,采用基因集富集分析方法分析DDIT4L相关的信号通路。结果 DDIT4L高表达是提示GBM术后患者预后不良的独立因素,其高表达与烟酸-烟酰胺代谢、组氨酸代谢、氮代谢、苯丙氨酸代谢相关通路增强有关。结论 DDIT4L高表达的GBM患者预后不良,可能通过对GBM中的烟酸-烟酰胺、组氨酸、氮或苯丙氨酸代谢的调节而发挥促肿瘤作用。

溴结构域蛋白4的结构和功能及其抑制剂在肿瘤研究中的应用

溴结构域和超末端结构域(bromodomain and extraterminal domain,Bet)家族是表观基因组的调节因子,也是肿瘤细胞生存所依赖的肿瘤相关基因表达的关键驱动因子。溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,Brd4)是溴域和端外蛋白家族中的一员,通常识别乙酰化组蛋白,并定位于目的基因的启动子或增强子区域,启动并维持肿瘤相关基因的表达。Brd4与多种转录因子调控和染色质修饰密切相关,并参与DNA损伤修复、维持端粒功能,从而维持肿瘤细胞的存活。本文围绕Brd4蛋白的结构、功能及其抑制剂在肿瘤研究中的应用进行综述。