胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4水平表达及其与临床病理特征和预后的关系

目的研究胶质瘤组织中甲状腺激素受体结合蛋白4(thyroid hormone receptor interacting protein 4,TRIP4)和DNA损伤诱导转录因子4(DNA damage inducing transcription factor 4,DDIT4)水平表达及其与临床病理特征和预后的关系。方法选取2018年2月~2019年2月河北医科大学第一医院收治的94例胶质瘤患者为研究对象。应用免疫组织化学法检测组织中TRIP4和DDIT4蛋白表达。比较不同临床病理特征脑胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4蛋白表达。采用Kaplan-Meier生存曲线分析不同TRIP4和DDIT4蛋白表达胶质瘤患者生存预后的差异。单因素和多因素COX回归分析影响胶质瘤患者生存预后的因素。结果胶质瘤组织中TRIP4(68.09%)和DDIT4(65.96%)蛋白阳性率高于瘤旁组织(13.83%,10.64%),差异具有统计学意义(χ^(2)=57.212,60.866,均P<0.05)。胶质瘤组织中TRIP4与DDIT4蛋白表达呈显著正相关性(r=0.722,P<0.05)。WHO分级Ⅲ级、肿瘤直径≥3cm胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4蛋白阳性率均高于WHO分级Ⅰ~Ⅱ级、肿瘤直径<3cm胶质瘤组织,差异具有统计学意义(χ^(2)=6.393~14.754,均P<0.05)。TRIP4阳性表达组和阴性表达组三年总体生存率分别为37.50%(24/64),66.67%(20/30),TRIP4阳性表达组三年累积生存率低于阴性表达组,差异具有统计学意义(Log-rankχ^(2)=5.949,P=0.015)。DDIT4阳性表达组和阴性表达组三年总体生存率分别为37.10%(23/62),70.00%(21/30),DDIT4阳性表达组三年累积生存率低于阴性表达组,差异具有统计学意义(Log-rankχ^(2)=7.642,P=0.006)。肿瘤直径≥3cm(HR=1.614,P=0.000),WHO分级Ⅲ级(HR=1.790,P=0.000),TRIP4阳性表达(HR=1.665,P=0.000),DDIT4阳性表达(HR=1.476,P=0.000)是影响胶质瘤患者生存预后的独立危险因素。结论胶质瘤组织中TRIP4和DDIT4蛋白表达升高,两者与肿瘤直径及WHO分级相关,是潜在的评估胶质瘤预后的肿瘤标志物。

circMAN1A2调节miR-212-3p/DDIT4轴对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的探究circMAN1A2靶向miR-212-3p/DNA损伤诱导转录子4(NDA damage-inducible transcript 4,DDIT4)轴对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法qRT-PCR法检测胃癌组织和细胞中circMAN1A2、miR-212-3p表达水平。荧光素酶检测circMAN1A2与miR-212-3p、DDIT4和miR-212-3p的靶向关系。在胃癌细胞SGC-7901、HGC-27中转染si-NC、si-circMAN1A2、si-circMAN1A2+anti-NC、si-circMAN1A2+anti-miR-212-3p、miR-NC、miR-212-3p mimics,将未转染的SGC-7901、HGC-27细胞设为对照。平板克隆实验检测细胞增殖;细胞划痕及Transwell实验分别检测细胞迁移、侵袭能力。Western blotting检测增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达。结果在胃癌组织及细胞中,circMAN1A2高表达,miR-212-3p低表达;下调circMAN1A2可以靶向上调miR-212-3p表达,且下调DDIT4表达,进而抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力。抑制miR-212-3p表达可部分逆转抑制circMAN1A2表达对胃癌细胞恶性增殖的抑制作用。结论在胃癌细胞中抑制circMAN1A2表达可抑制胃癌细胞增殖、迁移与侵袭,其与调节miR-212-3p/DDIT4信号轴有关。

DDIT4通过自噬相关通路影响大肠癌的发生研究

目的观察DNA损伤诱导转录物4(DDIT4)在大肠癌(CRC)组织和癌旁组织中的表达,探索其与临床病理特征的相关性、预后及作用机制。方法从癌症基因组图谱(TCGA)数据库收集CRC数据集,比较DDIT4mRNA的表达及预后相关性分析,筛选关键基因进行功能富集分析。收集2022年5月至2023年5月在温州医科大学黄岩医院诊断为CRC的石蜡标本观察组100例,对照组60例,通过免疫组化染色检测肿瘤和癌旁DDIT4的表达,并进行临床病理特征的相关性分析。培养CRC及正常肠上皮细胞系,RT-PCR检测其DDIT4 mRNA的表达,基因干预DDIT4的表达,Western blot法检测自噬通路相关蛋白(mTOR、p-mTOR、Beclin1、P62)的表达。结果TCGA数据库数据和免疫组化结果显示DDIT4在CRC中表达显著增加(P<0.001),与患者总体生存率、浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移、DUKES分期和血清CEA水平相关(P<0.05)。沉默DDIT4基因,mTOR自噬相关通路下游p-mTOR/mTOR比值及P62相对升高,Beclin1相对降低(P<0.05)。结论DDIT4基因与CRC的发生发展及不良预后显著相关,其机制可能与DDIT4参与调控mTOR信号通路激活自噬有关。

DNA损伤诱导转录因子4过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制HT-22细胞增殖并促进其凋亡

神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一种由细胞增殖凋亡紊乱引起的先天缺陷性疾病。本室前期利用RNA-Seq技术,发现小鼠神经管畸形胚胎脑组织中DNA损伤诱导转录因子-4(DNA damage-inducible transcript 4,Ddit4)表达水平增加,但其在神经管畸形中的作用尚不清楚。本文拟探索Ddit4过表达对海马神经元HT-22细胞增殖和凋亡的影响及相关机制,从而为后续研究Ddit4在小鼠神经管畸形中的作用奠定基础。本研究首先根据小鼠Ddit4序列构建真核表达载体pEX-3-Ddit4,限制性酶切分析和测序结果表明pEX-3-Ddit4构建成功。qRT-PCR和Western印迹检测显示转染pEX-3-Ddit4后,HT-22细胞中DDIT4的表达水平明显增加(P<0.01)。CCK-8和Western印迹结果显示,Ddit4过表达导致HT-22细胞增殖下降(P<0.01)。流式细胞仪结果显示,转染pEX-3-Ddit4后,G0/G1期细胞比例增加、S期比例下降(P<0.01),细胞凋亡率增加(P<0.05)。Western印迹检测发现,转染pEX-3-Ddit4能够显著上调切割胱天蛋白酶3(cleaved caspase3)水平(P<0.05),表明Ddit4过表达促进HT-22细胞凋亡。细胞免疫荧光及Western印迹结果显示,过表达Ddit4显著降低细胞β-联蛋白(β-catenin)、T细胞因子4、细胞周期蛋白D1和C-myc的表达水平(P<0.05),核内β-联蛋白减少,提示Ddit4过表达抑制了Wnt/β-catenin信号通路。过表达Ddit4的同时加入Wnt/β-catenin信号通路激动剂LiCl处理细胞可逆转上述现象,表明Ddit4过表达可能通过Wnt/β-catenin信号通路对HT-22细胞发挥抗增殖和促凋亡作用。

miR-22通过靶向抑制DDIT4促进糖尿病肾病肾小管上皮细胞DNA损伤

目的:探究在糖尿病肾病(DKD)中微小RNA-22(miR-22)是否能靶向抑制DNA损伤诱导转录物4(DDIT4)的表达,进而通过毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(ATM)-细胞周期检查点激酶2(Chk2)通路促进DNA损伤。方法:(1)C57BL小鼠建立糖尿病(DM)模型,于16周后处死,分析其生化指标并对肾脏组织做HE染色,Western blot检测肾脏组织中p-ATM、p-Chk2和DDIT4蛋白水平;(2)分别用高糖(30 mmol/L葡萄糖)和正常糖(5.5 mmol/L葡萄糖)培养基培养大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E,彗星实验检测DNA双链断裂程度,流式细胞术检测高糖对细胞周期的影响,Western blot检测细胞中p-ATM、p-Chk2和DDIT4蛋白水平;(3)构建DDIT4过表达质粒,转染NRK-52E细胞后通过彗星实验检测DDIT4过表达对DNA双链断裂的影响,并构建miR-22模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor),分别转染miR-22 mimics和inhibitor,通过Western blot检测细胞中p-ATM、p-Chk2和DDIT4蛋白水平。结果:(1)DM组小鼠肾组织中p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著增高,DDIT4蛋白水平显著下降(P<0.05)。(2)高糖培养的NRK-52E细胞比正常糖培养的细胞彗尾更长,p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著增高,DDIT4蛋白水平显著下降(P<0.05)。(3)高糖培养的NRK-52E细胞过表达DDIT4后,p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著降低,细胞彗尾变短;转染miR-22 mimics后,p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著增高,DDIT4蛋白水平显著下降;转染miR-22 inhibitor后,p-ATM和p-Chk2蛋白水平显著下降,DDIT4蛋白水平显著增高(P<0.05)。结论:高糖可导致DNA损伤加重,其机制可能为miR-22靶向抑制DDIT4表达,诱导肾小管上皮细胞发生DNA损伤,从而促进DKD的发生发展。

DNA损伤诱导转录子4基因在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨DNA损伤诱导转录子4(DNA damage inducible transcript 4,DDIT4)基因在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中的表达水平及其临床意义。方法:分别下载癌症和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的OSCC队列数据(n=362)及基因表达综合(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中的GSE42743数据集(n=103)。比较OSCC组和正常对照组中DDIT4的表达水平,并分析DDIT4与OSCC患者临床特征和预后的关系。此外,利用生物信息学方法寻找DDIT4可能参与的生物学功能。结果:DDIT4在OSCC组中的表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。在OSCC患者中,DDIT4的表达水平与肿瘤分期呈正相关(P<0.001),且OSCC高表达组的总生存率明显低于低表达组(Log-rank检验,P<0.01)。进一步行Cox回归分析,结果提示DDIT4高表达是OSCC患者预后不良的独立预测因素(P<0.05)。生物信息学分析表明,DDIT可能与低氧反应、糖酵解、雷帕霉素靶蛋白C1(mammalian target of rapamycin C1,mTORC1)信号通路、核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)介导的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)信号通路、G 2M检查点、p53信号通路等生物学功能有关。结论:DDIT4基因在OSCC患者中呈高表达状态,并且其表达水平与肿瘤分期有关。高表达DDIT4基因的OSCC患者预后不佳。因此,DDIT4可作为OSCC预后评估的一种标记物。

LncRNA SNHG15通过miR-483-3p/DDIT4轴调节非小细胞肺癌细胞的顺铂敏感性和上皮间质转化

目的 探究LncRNA SNHG15对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的顺铂(DDP)敏感性和上皮间质转化的影响以及miR-483-3p/DNA损伤诱导转录物4(DDIT4)轴在其中发挥的作用。方法 体外培养NSCLC细胞(A549)、NSCLC耐药细胞(A549/DDP),检测两种细胞对DDP的IC50及LncRNA SNHG15、miR-483-3p、DDIT4 mRNA与蛋白表达,将A549/DDP细胞随机分为A549/DDP组、si NC组、si SNHG15组、si SNHG15+inhibitor NC组、si SNHG15+miR-483-3p inhibitor组、si SNHG15+miR-483-3p inhibitor+si NC组、si SNHG15+miR-483-3p inhibitor+si DDIT4组;蛋白印迹分析法检测各组细胞E-cad、N-cad、DDIT4蛋白表达变化;双荧光素酶报告实验验证miR-483-3p与LncRNA SNHG15、DDIT4的靶向关系。结果 与A549细胞相比,A549/DDP细胞对DDP的IC50、LncRNA SNHG15、DDIT4 mRNA与蛋白升高,miR-483-3p水平降低(P <0.05);A549/DDP组细胞间黏附明显被破坏;si SNHG15组、si SNHG15+miR-483-3p inhibitor+si DDIT4组细胞排列相对紧密,呈现上皮细胞特性;si SNHG15+miR-483-3p inhibitor组较si SNHG15组细胞排列松散、扩散细胞多;与A549/DDP组相比,si SNHG15组A549/DDP细胞增殖抑制率、E-cad表达升高,侵袭细胞数、迁移细胞数、N-cad、DDIT4表达降低(P <0.05);与si SNHG15组相比,si SNHG15+miR-483-3p inhibitor组A549/DDP细胞增殖抑制率、E-cad表达降低,侵袭细胞数、迁移细胞数、N-cad、DDIT4表达升高(P <0.05)。结论沉默A549/DDP细胞中SNHG15表达可通过调控miR-483-3p/DDIT4,抑制A549/DDP细胞增殖、侵袭、迁移、EMT,并降低A549/DDP细胞对DDP的耐药性。

多房棘球蚴囊液对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响

目的探讨多房棘球蚴囊液(Hydatid cyst fluid,HCF)对沉默DNA损伤诱导转录因子4(DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4)后小鼠肝细胞生物学功能的影响。方法1.采用免疫蛋白印迹法(Western Blot)、实时荧光定量法(RT-qPCR)检测经HCF处理的小鼠肝细胞中DDIT4蛋白的表达量,以检测转染效率;2.选用慢病毒转染小鼠正常肝细胞DDIT4后做HCF处理,采用细胞计数试剂8法(CCK-8)检测各组小鼠肝细胞的细胞活性;3.用Western Blot法检测Beclin-1、Caspase-3、LC3等凋亡自噬相关蛋白水平;4.用透射电镜观察HCF对小鼠肝细胞超微结构的影响。结果1.经HCF作用后慢病毒转染小鼠肝细胞的DDIT4基因及蛋白表达水平检测结果显示,LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3组分别与LV-Ddit4-NC组比较,前三组DDIT4蛋白含量显著下降,LV-Ddit4-RNAi 3组尤为显著(P<0.01)。2.LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL组细胞OD值明显大于LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL组(P<0.01);与HCF共培养48 h后,沉默DDIT4组细胞形态接近正常AML-12细胞的形态,多呈椭圆形或者圆形,且细胞生长密度较LV-Ddit4-NC组明显为高。3.与LV-Ddit4-NC con组比较,LV-Ddit4-NC 0.4 mg/mL HCF组和LV-Ddit4-NC 0.8 mg/mL HCF组的LC3-II、Beclin-1、Caspase-3蛋白表达水平显著增高(P<0.01);分别与LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL HCF组比较,LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL HCF组的LC3-II、Beclin-1、Caspase-3蛋白表达水平显著降低,均具有统计学意义。4.两对照组细胞胞质未见明显损伤,线粒体基质较均匀,粗面内质网未见明显扩张,自噬水平低;LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL组细胞损伤较轻,未见粗面内质网扩张,胞质内存在较多脂滴,自噬数量增多;LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL组细胞损伤严重,粗面内质网严重扩张,胞质内存在大量脂滴,可见大量自噬结构。结论HCF对沉默DDIT4后小鼠肝细胞生物学功能的影响:1.AML-12细胞增殖;2.AML-12细胞凋亡、自噬数量减少。

DDIT4对脑缺血再灌注损伤中自噬的调控作用

脑卒中（stroke）是危害人类健康与生命的常见病和多发病,是造成我国居民死亡的首位原因^（[1]）,其中缺血性脑卒中（ischemia stroke）的发病率及致死致残率更是居高不下,约占全部脑血管病的60%～80%。

GADD45β在肝癌中的异常表达

目的:探讨生长抑制DNA损伤诱导因子β(GADD45β)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展的关系.方法:应用寡核苷酸基因芯片、反转录PCR(RT-PCR)、免疫组织化学技术检测GADD45β在人正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中的异常表达,分析GADD45β与临床病理学特征的关系及其异常表达的可能分子生物学机制.结果:正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中GADD45β mRNA的阳性表达率分别为80%、60%和26%,肝癌组织与正常肝组织间有非常统计学差异(χ2=15.128,P<0.01);GADD45β蛋白的阳性表达率在正常肝组织、肝硬化组织和肝癌组织中分别为85%、70%和31%,有显著统计学差异(χ2=24.619,P<0.01).GADD45β在肝癌组织中的表达缺失与病理学分级显著相关(P<0.01).结论:GADD45β作为抑癌基因在肝癌的发生发展中起到相当重要的作用,且与肿瘤分化程度密切相关.

脓毒症患儿外周血CD4+T细胞Bip、ATF6及DDIT3表达水平变化

目的:探讨脓毒症(Sepsis)患儿外周血CD4^+T淋巴细胞免疫球蛋白结合蛋白(Bip)、激活转录因子6(ATF6)及内质网应激(ERS)特异性促凋亡因子DNA损伤诱导转录蛋白3(DDIT3)mRNA水平的变化。方法:收集确诊脓毒症儿童60例,根据出院结局分为存活组和死亡组各30例,另外选取同期健康儿童30例作为对照组。对60例危重病例进行评分(PCIS);采集三组外周静脉血标本,分离外周血CD4^+T淋巴细胞,实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法测定外周血CD4^+T淋巴细胞Bip、ATF6及DDIT3 mRNA的相对表达水平。PCR产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定特异性。结果:脓毒症存活组C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、白介素-6(IL-6)、血乳酸、D-二聚体及脑尿钠肽(BNP)均低于死亡组,PCIS评分高于死亡组,差异有统计学意义(t=7.77、11.40、21.88、5.11、9.53、4.27、2.80,均P<0.01)。三组Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相对表达水平比较差异有统计学意义(F=586.49、313.55、764.23,均P<0.01),存活组Bip、ATF6及DDIT3水平高于对照组[(3.01±0.67)与(1.00±0.32)、(2.17±0.37)与(1.00±0.28)、(4.44±0.64)与(1.00±0.20)],而低于死亡组[(3.01±0.67)与(6.63±0.84)、(2.17±0.37)与(3.26±0.39)、(4.44±0.64)与(10.02±1.41)]。存活组确诊时与治疗后Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相对表达水平比较差异有统计学意义(t=16.31、19.20、39.10,均P<0.01),存活组治疗后Bip、ATF6及DDIT3 mRNA相对表达水平低于确诊时水平。结论:脓毒症患儿外周血CD4^+T淋巴细胞Bip、ATF6及DDIT3表达水平增高,且随病情好转而降低,可通过ERS导致外周血CD4^+T细胞凋亡,从而在脓毒症多器官功能障碍综合征(MODS)的发生发展中起重要作用。

转录因子ATF3对大鼠Gadd45β/γ基因启动活性的影响及其可能的结合部位

目的 :构建大鼠生长阻滞及DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45,Gadd45)β/γ启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在大鼠肾小球系膜细胞(glomerular messangial cells,GMCs)中过表达激活转录因子3(activating transcription factor 3,ATF3)后分别对大鼠Gadd45β/γ基因启动活性的影响。同时筛选其可能的ATF3结合位点。方法:采用PCR技术,将扩增出的大鼠Gadd45β基因启动子全长(-1 105^+236 nt)和Gadd45γ基因启动子全长(-913^+72nt)分别插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得Gadd45β/γ基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-Gadd45β/γ-FL),再将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别与课题组前期构建的大鼠野生型ATF3过表达质粒(p IRES2/ATF3)共转染GMCs,检测其荧光素酶活性,以确定ATF3对Gadd45β/γ基因的启动作用。另用生物信息学软件预测Gadd45β/γ基因启动子上ATF3潜在的结合位点,并据此构建4个Gadd45β和3个Gadd45γ基因启动子截短片段的荧光素酶报告质粒。将Gadd45β/γ基因启动子全长和各截短片段的荧光素酶报告质粒与p IRES2/ATF3共转染GMCs,再行荧光素酶活性测定,以筛选ATF3的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠Gadd45β/γ基因启动子(全长和截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-Gadd45β/γ-FL分别和p IRES2/ATF3共转染GMCs发现,Gadd45β/γ基因启动子活性均显著增加。而将Gadd45β启动子全长及4个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45β-4的启动活性显著低于p GL3-Gadd45β-FL、p GL3-Gadd45β-1、p GL3-Gadd45β-2和p GL3-Gadd45β-3。提示ATF3可能结合在Gadd45β基因启动子的(-146^+23 nt)区域。同样,将Gadd45γ启动子全长及3个截短质粒分别与p IRES2/ATF3共转染GMCs后显示,p GL3-Gadd45γ-2、p GL3-Gadd45γ-3的启动活性显著低于p GL3-Gadd45γ-FL和p GL3-Gadd45γ-1。提示ATF3可能结合在Gadd45γ基因启动子的(-456^-61 nt)区域,且这段区域可能包含1个以上ATF3结合位点。结论:成功构建了大鼠Gadd45β/γ基因启动子全长及各截短片段荧光素酶报告质粒,并初步确定了ATF3在Gadd45β/γ基因启动子上的结合区域。

DDIT4在皮肤基底细胞癌中的表达及对细胞增殖和自噬通路的调控

目的:检测DNA损伤诱导转录因子-4(DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4)在皮肤基底细胞癌(basal cell carcinoma,BCC)中的表达及其对下游的细胞蛋白合成、增殖和自噬水平的影响。方法:采用免疫组化和Western blot分别对15例人皮肤BCC组织和正常皮肤15例进行检测,比较两者DDIT4、p S6K1、p4E-BP1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表达。结果:与正常组织相比,DDIT4(0.247±0.152,P=0.005)在BCC中的表达被明显抑制,伴p4E-BP1表达(0.290±0.169,P=0.015)和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(0.692±0.154,P=0.007)降低,但p S6K1(0.837±0.050,P=0.000)表达明显增加,具有统计差异。结论:DDIT4在BCC中的表达受抑制,可能通过其下游的mTORC1通路进而促进癌细胞的蛋白合成和增殖能力,但自噬流受阻,参与BCC的发生发展过程;DDIT4及其下游通路信号可能作为BCC的进一步治疗及预后研究的靶点。

DDIT3免疫组织化学检测在黏液样脂肪肉瘤诊断中的意义

目的评估DNA损伤诱导转录因子3(DNA-damage inducible transcription 3,DDIT3)免疫组织化学检测诊断黏液样脂肪肉瘤的可靠性及在黏液样脂肪肉瘤诊断及鉴别诊断中的意义。方法收集山西省肿瘤医院2014至2021年经荧光原位杂交检测确诊的黏液样脂肪肉瘤病例42例作为实验组,并选取其他圆细胞肿瘤及高分化脂肪肉瘤共73例作为对照组。采用免疫组织化学染色检测实验组与对照组DDIT3表达水平,采用Wilcoxon符号秩检验进行统计学分析。结果在实验组中,35例(35/42,83%)病例显示DDIT3弥漫阳性定位于细胞核;在对照组中,16例(16/73,22%)病例存在不同程度的DDIT3表达;实验组中DDIT3表达水平显著高于对照组中圆细胞肿瘤组;DDIT3诊断黏液样脂肪肉瘤的灵敏度为83%,特异度为78%。结论DDIT3免疫组织化学检测可作为黏液样脂肪肉瘤诊断的辅助方法。

微小RNA-221-3p通过DDIT4抑制镉诱导的TM3细胞凋亡机制

目的探讨微小RNA(microRNA,miRNA)中的miR-221-3p靶向DNA损伤诱导转录本4(DNA-damage-inducible transcript 4,DDIT4)对镉诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响和机制。方法小鼠睾丸间质细胞(mouse testicular stromal cells,TM3)经不同浓度的镉(0、10、20、30和40μmol/L)染毒后,使用CCK-8检测细胞活性。提取镉染毒TM3细胞的总RNA,以差异倍数(fold change,FC)>1.2,P<0.05作为标准筛选显著差异表达miRNA。TM3细胞分为空白对照组、阴性对照组、镉染毒组(CdCl2,20μmol/L)和镉染毒+miR-221-3p模拟物组,其中对镉染毒+miR-221-3p模拟物组,先将miR-221-3p模拟物转染进TM3细胞,再联合镉染毒24 h。Hoechst染色检测细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡率,实时荧光定量PCR和Western blot免疫印迹法检测DDIT4表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-221-3p与DDIT4的结合,生物信息学分析DDIT4的功能及与细胞凋亡的关联,过表达miR-221-3p后观察B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)的表达水平。结果镉染毒可降低TM3细胞活性且存在剂量-效应关系。细胞形态学发现,与对照组相比,镉染毒组细胞皱缩、细胞核浓染,凋亡率升至19.66%±0.45%(P<0.01);与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组正常形态细胞增多,凋亡率降至13.76%±0.37%(P<0.05)。镉染毒组miR-221-3p表达水平下调(P<0.01),DDIT4表达水平上调(P<0.05)。生物信息学分析和双荧光素酶报告分析发现DDIT4为miR-221-3p的靶基因之一。与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组DDIT4表达水平下调(P<0.05),Bcl-2/BAX比值由0.54±0.03增加为0.71±0.04。结论miR-221-3p通过靶向DDIT4进而抑制镉诱导的TM3细胞凋亡。

miR-7-5p抑制胰腺癌细胞放疗后加速再增殖的体外实验研究

目的研究放疗后濒死胰腺癌细胞(PANC-1)释放的微小RNA-7-5p(miR-7-5p)对存活PANC-1加速再增殖效应的相关机制。方法通过慢病毒感染,建立荧光素酶标记的PANC-1-LUC胰腺癌细胞放疗后加速再增殖模型。通过RT-qPCR检测miRNA-7-5p的表达水平,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,双荧光素酶法验证miR-7-5p靶基因,Western blotting检测γH2A.X与DDIT4蛋白的表达情况。结果miR-7-5p在受辐照PANC-1(10 Gy)濒死细胞上清中表达下调,受辐照PANC-1细胞与存活PANC-1-LUC细胞共培养,可促进放疗后存活PANC-1-LUC细胞加速再增殖及其DNA损伤修复,而上调miR-7-5p可抑制放疗后胰腺癌细胞PANC-1-LUC再增殖。进一步研究表明,miR-7-5p在胰腺癌细胞中通过靶向下调DDIT4通路促进凋亡信号。结论受辐照胰腺癌细胞可通过下调miR-7-5p促进DDIT4表达,从而抑制细胞凋亡及调控细胞周期再分布来加速再增殖,表明提高miR-7-5p的水平能够提高胰腺癌细胞的放疗敏感性,这将为改善胰腺癌放疗抵抗提供了一种新的思路和方法。

高通量数据分析DNA损伤诱导转录样蛋白4在脑多形性胶质母细胞瘤中表达及临床意义

目的探讨DNA损伤诱导转录样蛋白4(DDIT4L)在人脑多形性胶质母细胞瘤(GBM)中的表达与患者预后的关系及相关机制。方法分别从癌症基因组图谱(TCGA)和人类肿瘤相关基因表达汇编(GEO)数据库下载GBM的RNASeq V2数据,以及GBM样本数据集GSE7696的系列矩阵数据。应用Kaplan-Meier和多因素COX逐步回归分析方法确定DDIT4L的预后价值,采用基因集富集分析方法分析DDIT4L相关的信号通路。结果 DDIT4L高表达是提示GBM术后患者预后不良的独立因素,其高表达与烟酸-烟酰胺代谢、组氨酸代谢、氮代谢、苯丙氨酸代谢相关通路增强有关。结论 DDIT4L高表达的GBM患者预后不良,可能通过对GBM中的烟酸-烟酰胺、组氨酸、氮或苯丙氨酸代谢的调节而发挥促肿瘤作用。

低浓度葫芦素-I诱导胃癌细胞G2/M期阻滞和细胞凋亡及其机制研究

背景:葫芦素-I通过抑制STAT3信号通路在多种恶性肿瘤中发挥强大的抗癌作用,但其在胃癌中是否同样具有抗癌作用及其作用机制,目前仍不清楚。目的:通过体外实验评估低浓度葫芦素-I对人胃癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响并初步探讨其可能作用机制。方法:以低浓度葫芦素-I处理人胃腺癌细胞株AGS和HGC-27,采用CCK-8试验和集落形成试验评估其对细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞周期转换相关蛋白表达以及caspase-3/PARP细胞凋亡途径、STAT3、GADD45α和JNK/p38 MAPK信号通路激活情况。结果:低浓度葫芦素-I可在不抑制STAT3信号通路的情况下发挥强大的胃癌细胞生长抑制作用,此作用是通过诱导细胞周期G2/M期阻滞和细胞凋亡实现的。机制研究发现葫芦素-I可通过上调GADD45α和激活JNK/p38 MAPK信号通路诱导细胞凋亡,发挥抗胃癌作用。结论:本研究揭示了葫芦素-I抗胃癌作用的新机制,证明葫芦素-I是一个具有临床应用前景的化疗药物。

溴结构域蛋白4的结构和功能及其抑制剂在肿瘤研究中的应用

溴结构域和超末端结构域(bromodomain and extraterminal domain,Bet)家族是表观基因组的调节因子,也是肿瘤细胞生存所依赖的肿瘤相关基因表达的关键驱动因子。溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,Brd4)是溴域和端外蛋白家族中的一员,通常识别乙酰化组蛋白,并定位于目的基因的启动子或增强子区域,启动并维持肿瘤相关基因的表达。Brd4与多种转录因子调控和染色质修饰密切相关,并参与DNA损伤修复、维持端粒功能,从而维持肿瘤细胞的存活。本文围绕Brd4蛋白的结构、功能及其抑制剂在肿瘤研究中的应用进行综述。

鱼腥草素钠对BALB/c小鼠的急性毒性及其对细胞的损伤

目的探索鱼腥草素钠(SH)急性毒性及其对腹腔细胞的损伤作用。方法观察BALB/c小鼠单次ip给予SH 50,125和200 mg.kg-1后的急性毒性反应及死亡情况,并进行病理组织学检查。检测小鼠单次ip给予SH后血浆中组胺的浓度。将SH与小鼠腹腔细胞进行体外孵育,检测乳酸脱氢酶(LDH)渗出和组胺释放。观察SH对人血红细胞的溶血作用。结果小鼠单次ip给予SH后,SH 50 mg.kg-1组没有观察到小鼠死亡,SH 200 mg.kg-1组小鼠全部死亡,死亡原因为肝充血。与正常对照组血浆中组胺浓度(45.8±9.6)μg.L-1相比,小鼠ip给予125 mg.kg-1后0.5 h血浆中组胺浓度为(66.1±3.9)μg.L-1,明显增加(P<0.05)。SH 0,32和128 mg.L-1体外处理小鼠腹腔细胞,上清中的相对含量LDH分别为1.2±1.1,19.2±3.3和30.6±3.1,组胺的浓度分别为36.5±9.0,73.3±3.8和(82.7±3.6)μg.L-1,与正常对照组相比明显增加(P<0.05)。溶血实验发现,SH能够引起小鼠及人血红细胞显著的溶血现象。结论 SH对小鼠具有一定的急性毒性,可引起小鼠腹腔细胞LDH和组胺的释放,并且SH具有溶血作用。