牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析

旨在筛选牛CART基因核心启动子区并鉴定调控CART表达的转录因子,探究其转录调控机制。本研究采集3头健康母牛下丘脑组织,提取基因组DNA,通过PCR扩增、测序获得牛CART启动子序列,EMBOSS、MethPrimer、New PLACE数据库分析启动子结构特征;构建4个包含不同截短长度的CART启动子报告基因载体,双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区;应用DNA pull down结合质谱分析(n=3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子;构建转录因子过表达载体,转染至293T细胞,分析转录因子对牛CART核心启动子区的转录调控功能(n=3)。结果表明,牛CART基因-1200 bp~+22 bp区域存在CpG岛和TATA box、CAAT box等顺式作用元件;构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性,-292 bp~+22 bp片段转录起始活性最强,为牛CART基因核心启动子区;转录因子RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA可与牛CART基因核心启动子区特异性结合;进一步研究证实RFX5、RFX1、TEAD4抑制CART转录(P<0.01),CREB与RELA激活CART转录(P<0.001)。本研究成功扩增获得牛CART启动子区域,筛选鉴定-292 bp~+22 bp为牛CART基因的核心启动子区,证实RFX5、RFX1、TEAD4为CART转录抑制因子,CREB、RELA为CART转录激活因子。研究结论为丰富牛下丘脑CART表达调控机制,深入研究CART调控卵泡发育机理提供依据。

前列腺癌组织中分化抑制蛋白1相互结合蛋白的分离

目的:分离前列腺癌组织中细胞分化抑制蛋白1(Id1)的相互结合蛋白,以探讨Id1在前列腺癌中的作用途径和机制。方法:首先构建PolyHis-Id1的表达载体pET-28a/Id1,并在大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,然后采用牵出试验钓取前列腺癌组织中的Id1相互结合蛋白。结果:蛋白电泳并染色后发现一清晰蛋白条带,用活化转录因子3抗体经Western印迹尝试检测发现其确为活化转录因子3。结论:在人前列腺癌组织中,Id1可能与活化转录因子3相互结合发挥效应。

红鳍东方鲀结合CCL25b核心启动子区转录因子的鉴定

基因转录调控一直是生物信息学研究的一个重要内容,转录因子与启动子区域上的特异性调控元件的结合在基因表达和调控中具有重要意义,是构建基因调控网络的一个核心问题。趋化因子配体25 (chemokine 25, CCL25)是一种属于CC趋化因子家族的小细胞因子,在免疫细胞调节和炎症过程如T细胞归巢和慢性组织炎症中均发挥重要作用。为了探究CCL25在表达过程中受到的转录调控机制,本实验我们初次采用聚合酶链式反应(PCR)扩增出红鳍东方鲀CCL25b的核心启动子区,并利用DNA pull down方法对结合在该序列的蛋白质进行富集,最后结合质谱鉴定数据及GO富集分析初步筛选出6个转录因子(C1QBP、PURA、ARHGAP35、NME2、RAP2C和DRG1),这些初步结果将有助于推进对与CCL25表达调节机制有关的潜在生物学过程的理解。

内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制研究

[目的]探讨内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制。[方法](1)DNA-pull down、2D-DIGE结合生物质谱技术筛选分离、鉴定对照和内毒素血症小鼠肝组织核蛋白与Rig-Ⅰ基因启动子结合的差异蛋白质;(2)q PCR和细胞免疫荧光检测LPS刺激RAW264.7细胞hnRNP A3 mRNA表达及细胞内定位。[结果](1)筛选鉴定得到hnRNP A3等7种与内毒素血症Rig-Ⅰ基因启动子结合的蛋白质;(2)LPS刺激下hnRNP A3 mRNA显著升高(P<0.01),且具有明显的细胞核定位。[结论]共有7种蛋白质参与内毒素血症Rig-Ⅰ基因表达调控,为进一步Rig-Ⅰ表达调控的研究奠定了良好基础。