大肠杆菌菌蜕装载质粒DNA实验方法的优化

目的:优化大肠杆菌菌蜕装载质粒的效率,并将装载质粒的菌蜕转染抗原提呈细胞,以提高核酸疫苗的递送水平。方法:将质粒pHH43转化大肠杆菌DH5α,制备大肠杆菌菌蜕;优化菌蜕装载质粒时菌蜕、质粒和膜囊的比例,获得更高的装载效率,通过扫描及透射电镜、流式细胞术观察其形态变化及装载效率;将装载质粒的菌蜕与抗原提呈细胞——巨噬细胞RAW264.7和树突状细胞DC2.4共孵育,观察吞噬效果。结果:优化了大肠杆菌菌蜕装载质粒的效率,当菌蜕、质粒、膜囊的比例为7∶10∶4时效率达到最佳,装载DNA效率达98%以上;抗原提呈细胞吞噬装载了质粒的菌蜕,效率达100%。结论:大肠杆菌菌蜕可高效装载核酸疫苗,且高效被抗原提呈细胞捕获,有助于提高核酸疫苗的递送和免疫效果的提高。

利用展示尿素酶B表位的大肠杆菌菌蜕递送幽门螺杆菌核酸疫苗

探讨和分析了重组大肠杆菌菌蜕递送系统能否进一步提高幽门螺杆菌核酸疫苗的免疫应答水平.首先构建了展示尿素酶B表位的重组大肠杆菌菌蜕,然后以此菌蜕包裹幽门螺杆菌核酸疫苗pcDNAKAT,经DNA凝胶电泳、荧光显微镜观察和FACS分析,表明该质粒DNA可以非特异地结合到大肠杆菌菌蜕内膜上.该核酸疫苗经重组菌蜕包裹后免疫小鼠,其血清抗过氧化氢酶抗体效价由单独免疫时的1∶(307±39)提高到1∶(520±54),二者差异极显著(P=0.005 8),结果表明利用菌蜕递送系统能较好地提高核酸疫苗的免疫应答水平.

新型细菌菌影应用的研究进展

细菌菌影(Bacterial ghosts)是通过诱导PhiX174噬菌体中裂解基因E在革兰阴性菌中的表达所获得的没有细胞内容物的空细菌体。它是一种新型的灭活菌疫苗,但却保持了与活菌相同的膜蛋白成分、天然结构、细胞表面抗原等特性。因此,细菌菌影能够诱导机体产生细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫。作为一种理想疫苗,细菌菌影具有内在佐剂的性质,免疫效率高、效果好。通过基因工程手段可利用细菌菌影来装载外源抗原递呈给免疫系统。因此,细菌菌影作为药物或DNA递送载体、菌影疫苗有着广阔的应用前景。

动物用菌影疫苗研究进展

动物用菌影疫苗是目前细菌疫苗研究的一个热点。菌影是革兰阴性菌在噬菌体PhiX174的裂解基因E表达产物作用下裂解后形成的完整细菌空壳,其保持了细菌完整的细胞膜结构,保留了细菌细胞的形态、黏附性和抗原特性。这种细菌外壳作为免疫原能够激发机体产生强烈的免疫反应,不需要添加佐剂,并且无致病性,与常规疫苗相比具有更好的安全性和有效性,有望为动物细菌性疾病疫苗的研制开发提供一种新思路。论文主要介绍了几种动物用菌影疫苗的最新研究进展,以期为动物用新型疫苗研究提供参考。

重组大肠杆菌菌蜕与幽门螺杆菌蛋白质疫苗协同免疫BALB/c小鼠

目的:考察重组菌蜕和蛋白质疫苗混合后对BAB/c小鼠机体免疫反应的影响。方法:首先构建展示尿素酶B抗原表位的大肠杆菌菌蜕,同时通过融合PCR构建分子内佐剂蛋白质疫苗rLTBKAT,然后分别利用该菌蜕和蛋白质疫苗免疫BAB/c小鼠。结果:当rLTBKAT和重组菌蜕联合口服免疫BAB/c小鼠时,其抗尿素酶B抗体的效价由单独免疫时的1∶(239±23)提高到1∶(681±76),二者差异极显著(P=0.009);而其抗过氧化氢酶抗体的效价则由单独免疫时的1∶(2800±275)下降至1∶(1800±400),二者差异不显著(P=0.08)。抗体分型试验表明,单独和联合免疫时,其抗尿素酶B抗体类型均以IgG1为主,而抗过氧化氢酶抗体类型则由单独免疫时的IgG1为主转变为联合免疫时的IgG2a为主。联合免疫时,小鼠抗尿素酶B和抗过氧化氢酶IgA抗体水平均高于单独免疫时。结论:重组菌蜕和蛋白质疫苗联合免疫,可提高机体对某些抗原的免疫水平或改变其反应类型。

细菌菌影在DNA疫苗研究中的作用

免疫应答水平低下是制约DNA疫苗发展的一个障碍。细菌菌影(bacterialghost,BG)是利用φX174噬菌体的裂解蛋白将革兰氏阴性细菌裂解后形成的空腔,它保留了细菌结构的完整性,具有免疫佐剂的特性,可以作为递送载体,靶向性的将DNA疫苗导入到抗原递呈细胞,从而提高DNA疫苗的免疫应答水平,此外,装载核酸疫苗的细菌菌影可以通过多种方式进行免疫,例如,肌肉注射、皮下注射、口服、黏膜免疫等,更是从根本上提高了DNA疫苗的免疫水平,因此可以说BG是一个极具潜力的核酸疫苗递送载体。现就BG的特性及其在DNA疫苗递送载体中应用的最新进展做一综述。

细菌影载体负载防龋DNA疫苗免疫小鼠的效果研究

目的研制鼠伤寒沙门菌细菌影,负载防龋DNA疫苗,探寻增强防龋DNA疫苗黏膜免疫效能的方法.方法将pREP4质粒和噬菌体PhiX基因E表达质粒同时转入鼠伤寒沙门菌减毒株J357中,加入异丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,收集洗涤,负载防龋DNA疫苗,分4组经鼻免疫小鼠,分别为：细菌影＋pGJGLU/VAX组,细菌影负载5μg防龋DNA疫苗pGJGLU/VAX;细菌影＋pVAX1组,细菌影负载5μg空载体pVAX1;pGJGLU/VAX组,布比卡因包裹5μgpGJGLU/VAX;pVAX1组,布比卡因包裹5μgpVAX1.酶联免疫吸附测定（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）法检测唾液抗体产生结果.结果ELISA结果显示经鼻黏膜免疫鼠伤寒沙门菌J357细菌影负载的防龋DNA疫苗pGJGLU/VAX（细菌影＋pGJGLU/VAX组）后,诱导了显著的唾液特异性抗葡聚糖结合区的IgA抗体,（x）＆#177;sx为（0.367＆#177;0.086）A/μg,与细菌影＋pVAX1组[（0.122＆#177;0.077）A/μg]、pGJGLU/VAX组[（0.068＆#177;0.068）A/μg]和pVAX1组[（0.089＆#177;0.089）A/μg]相比,差异均有统计学意义（P值分别为0.028、0.012和0.030）.结论成功制备了鼠伤寒沙门菌细菌影,负载防龋DNA疫苗后经鼻黏膜途径免疫小鼠能有效提高免疫效能.

大肠杆菌菌蜕作为核酸疫苗载体的实验方法研究

目的制备大肠杆菌DH5α菌蜕,并用其装载核酸片段以及质粒DNA,体外转染抗原递呈细胞,探讨其作为DNA疫苗载体的可能性。方法将构建有φX174噬菌体裂解蛋白的温控型表达质粒pHH43转化入大肠杆菌DH5α中,诱导细菌裂解制备大肠杆菌DH5α菌蜕,利用制备的DH5α菌蜕装载核酸片段,并摸索出较好的装载方法用于质粒DNA的装载,然后转染巨噬细胞RAW264.7,观察转染效果。结果成功制备了大肠杆菌DH5α菌蜕,细菌的裂解效率可达97.8%,对核酸片段和质粒DNA的装载效率分别达94.89%和91.98%,装载红色荧光蛋白质粒pDSred-N1的DH5α菌蜕转染巨噬细胞RAW264.7,红色荧光蛋白的表达效率可达50%。结论大肠杆菌DH5α菌蜕可以用于装载核酸疫苗并将其靶向性地导入到抗原递呈细胞中,可获得较高的表达效率,初步验证了大肠杆菌DH5α菌蜕作为核酸疫苗载体的可行性。