防龋基因疫苗pcDNA3-PAc不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的:观察防龋基因疫苗pcDNA3-PAc经不同途径免疫BALB/c小鼠后的免疫效果。方法:重组质粒pcDNA3-PAc经颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注免疫BALB/c小鼠,共免疫2次,每次间隔2周。分别于首次免疫前1d和免疫后第1、2、4周采集血液和唾液样品,采用酶联免疫吸附方法检测血清特异性IgG抗体和唾液特异性IgA抗体。结果:各实验组免疫后1周血清和唾液中特异性抗体水平开始升高,第4周时达最高水平。颌下腺区皮下注射免疫产生的唾液IgA和股四头肌注射免疫诱导的血清IgG抗体水平明显高于其它实验组(P<0.05)。颌下腺区皮下注射免疫和鼻腔黏膜滴注免疫可诱导较高水平的唾液IgA和一定水平的血清IgG;股四头肌注射免疫诱导的血清特异性IgG抗体水平较高(P<0.05),而唾液IgA抗体水平不如颌下腺区皮下注射免疫和鼻腔黏膜滴注免疫(P<0.05)。结论:防龋基因疫苗pcDNA3-PAc能够诱导动物机体产生有效的系统免疫应答和黏膜免疫应答。

防龋基因疫苗pcDNA3-PAc兔鼻腔黏膜免疫防龋的实验研究

目的：观察防龋基因疫苗pcDNA3-PAc经鼻腔黏膜免疫日本长耳大白兔后的免疫反应性，确定不同剂量质粒pcDNA3-PAc免疫机体后的抗体效价。方法：30只日本长耳大白兔随机分为5组，每组6只，分别为200、400、600μg pcDNA3-PAc质粒组；400μgpcDNA3质粒组（阴性对照组）；灭活全菌疫苗组（阳性对照组）。质粒组及全菌组以1：1比例添加弗氏佐剂后进行免疫，共免疫2次。采用间接ELISA法检测血液、唾液中特异性IgG、S—IgA抗体。采用SPSS17．0软件包对数据进行统计学分析。结果：①血液、唾液中抗体高峰时间为初始免疫后8～10周左右；②自免疫后第3周开始，200、400、600μg组兔血清、唾液中特异性抗PAc的IgG、S-IgA抗体水平与阴性对照组相比，差异有显著性（P〈0．05）；③200μg组与400μg及600μg组相比，多时间点差异有显著性（P〈0．05）。结论：①防龋基因疫苗pcDNA3-PAc具有免疫反应性，可诱导免疫反应长达14周；②200、400、600μg的防龋基因疫苗pcDNA3-PAc对体重1．5kg左右的兔都是有效的免疫剂量；③在本研究条件下，400、600μg疫苗组效价优于200μg组。

表达嵌合体蛋白PAcA/CTB的转基因番茄口服免疫大白兔的实验研究

目的:观察表达嵌合体蛋白PAcA/CTB转基因番茄防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性。方法:新西兰大白兔随机分为实验组、阴性对照组和阳性对照组3组,分别喂食3个剂量(目的蛋白量相差1.5倍)的转基因番茄汁、非转基因番茄汁和变异链球菌灭活全菌疫苗。每周免疫1次,连续免疫4周,ELISA法检测免疫前和免疫后不同时期血液、唾液样品中抗变异链球菌PAc的IgG、IgA抗体效价。结果:口服免疫后实验组与阳性对照组大白兔血液和唾液中均出现特异性的抗PAc抗体,抗体水平可维持数周,而阴性对照组抗体水平变化不明显。结论:表达嵌合体蛋白PAcA/CTB的转基因番茄能够诱导动物机体产生有效的系统免疫应答和黏膜免疫应答。

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的:观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法:将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果:颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论:DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。

DNA防龋疫苗联合蛋白质疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的:研究以一种新型免疫策略即追加相应蛋白质抗原来加强免疫DNA疫苗的免疫效果。方法:重组质粒pCIA-P经鼻腔滴注途径免疫小鼠,并以其相应抗原rPAc蛋白或rPAc蛋白及黏膜佐剂rCTB经鼻腔滴注加强免疫,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平。结果:以rPAc蛋白或rPAc蛋白及黏膜佐剂rCTB加强免疫可显著提高唾液中IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体水平。并且以rPAc蛋白和黏膜佐剂rCTB加强免疫组产生了最高水平的唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体。结论:DNA防龋疫苗联合蛋白质疫苗可有效增强DNA防龋疫苗免疫效果。

表达嵌合体蛋白PAcP/CTB的转基因番茄免疫BABL/c小鼠的实验研究

目的:观察表达变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合蛋白(PAcP/CTB)的转基因番茄的免疫原性和安全性。方法:取24 d龄BABL/c小鼠18只,随机分成3组(n=6),分别用转基因番茄果汁(实验组)、变异链球菌灭活全菌(阳性对照组)、非转基因番茄果汁(阴性对照组)灌胃免疫,共4次,每次间隔1周;于首次免疫前1 d和每次免疫后1周称体质量,采集血清、唾液样品,用ELISA法检测血清中IgG、唾液中SIgA抗体水平;最后1次采样后处死所有动物,取心、肝、脾、肺、肾进行组织病理检查。结果:免疫后,实验组和阳性对照组小鼠血清特异性IgG和唾液特异性SIgA水平均明显升高,与阴性对照组相比P<0.05;各组小鼠免疫前后的体质量变化均无统计学差异(P﹥0.05);组织病理学检查,实验组心、肝、脾、肺、肾均未见明显异常。结论:转基因番茄表达的外源目的蛋白PAcP/CTB具有免疫原性和一般安全性。

DNA防龋疫苗不同途径免疫BALB/c小鼠的实验研究

目的 :观察编码pac结构基因A -P片段的重组质粒pCIA -P以不同途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应。方法 :重组质粒pCIA -P经鼻腔滴注和颌下腺区皮下腺注射两种途径免疫小鼠 ,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。结果 :滴鼻法和皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高 ,并持续数周。且滴鼻法比皮下注射法诱导唾液IgA型特异性抗体要早。结论 :重组质粒pCIA -P是一种有效的免疫原 ,滴鼻法和颌下区皮下注射法接种防龋DNA疫苗都可有效诱导机体全身及局部黏膜免疫应答。而滴鼻法较皮下注射法能更早诱导局部黏膜免疫应答。

表达嵌合体蛋白PAcP/CTB的转基因番茄防龋疫苗口服免疫大白兔的研究

目的观察表达嵌合体蛋白PAcP/CTB转基因番茄防龋疫苗的免疫原性和免疫反应性。方法用PAc标准蛋白制作标准曲线,ELISA法检测番茄果实PAcP/CTB蛋白的浓度。实验动物按完全随机分组法分为3组,实验组喂食3个剂量(PAcP/CTB蛋白量相差1.5倍)的转基因番茄汁,阴性对照组喂食非转基因番茄汁,阳性对照组喂食变异链球菌灭活全菌疫苗。每周免疫1次,免疫4周,ELISA法检测大白兔唾液和血液样品中抗变异链球菌PAc的IgA、IgG抗体效价水平。结果转基因番茄中PAcP/CTB嵌合蛋白的浓度为9.37μg/mL。疫苗免疫动物后实验组与阳性对照组大白兔唾液和血液中的特异性抗PAc抗体升高,抗体水平可维持数周,而阴性对照组抗体水平变化不明显。结论表达嵌合体蛋白PAcP/CTB的转基因番茄免疫新西兰大白兔后,能有效的诱导唾液和血液中特异性抗体的产生,其具有较好的免疫原性。

变形链球菌DNA酶切片段在大肠杆菌中克隆的研究

将变链菌染色体DNA和pBR322 DNA,分别用HindⅢ酶切,再用T_4DNA连接酶连接,转化到大肠杆菌R_5受体菌中。根据插入灭活的原理,筛选Ap^r、Tc^s菌株,并经抗药性、琼脂糖凝胶电泳,酶切、核酸杂交及再转化等试验证明,已将变链菌DNA酶切片段克隆到大肠杆菌中,获得2627个克隆株,建立了基因库。为筛选变链菌保护性抗原基因,进一步研制基因工程龋齿菌苗奠定了基础。

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB/c小鼠实验研究

目的观察编码PAc结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法将25只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论重组质粒pCIA-P是一种有效的免疫原,该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。

变形链球菌基因疫苗pc DNA3-gtfB鼻黏膜免疫家兔的实验研究

目的观察变形链球菌防龋基因疫苗pcDNA3-gtfB经鼻腔黏膜免疫日本长耳大白兔后的免疫反应性，初步观察不同剂量质粒pcDNA3-gtfB免疫机体后的抗体效价。方法实验分两部分，第一部分：30只日本长耳大白兔平均分为5组，每组6只，分别为：200μg、400μg、600μgpcDNA3-gtfB佃质粒组，400μg pcDNA3组，灭活全菌疫苗阳性对照组。质粒组及全菌组以1：1比例添加弗氏佐剂后进行免疫，共免疫两次。第二部分：采用间接ELISA法检测血液、唾液中特异性IgG、S-IgA。结果①血液、唾液中抗体高峰时间为初始免疫后8～10周左右；②自免疫后1～2周，各质粒组兔血液、唾液中特异性抗GTF的IgG、S-IgA抗体水平同阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）；③200μg组与400μg及600μg组比较多时点差异有统计学意义（P〈0．05）。结论①基因疫苗pcDNA3-gtfB具有免疫反应性；②200μg、400μg、600μg的基因疫苗对于体重1．5kg左右的兔都是有效的免疫剂量；③在本研究的条件下，400μg、600μg疫苗组效价优于200μg组。

二价双启动子防龋DNA疫苗的构建及鉴定

目的:构建并鉴定具有在真、原核细胞中均可表达目的抗原并具备强免疫原性、针对致龋菌变形链球菌2种主要毒力因子的DNA疫苗。方法:利用PCR技术从载有变形链球菌gtfB基因的质粒中扩增葡聚糖结合区段(CBR)基因片断;将合成的组织纤溶酶原信号肽序列(tPA-SP)连接到GBR基因的上游;再将此基因(sGBR)定向克隆到载有sSBR基因的双启动子真核表达载体pCN-SSIE上,构建出pCN-SSISG;对重组质粒pCN-SSISG进行酶切图谱分析和DNA序列测定。结果:酶切图谱分析显示,PCR扩增的及插入到pCN-SSIE中的目的基因sGBR片断大小与预期相符; DNA序列测定结果确定:重组质粒pCN-SSISG开放性阅读框架和插入的信号肽序列均正确。结论:成功构建了具有在真核、原核宿主细胞均可表达的具有双启动子的质粒pCN-SSISC。

编码PAc结构基因的DNA疫苗免疫动物的实验研究

目的 本项研究将已构建的编码pac结构基因A P片段的重组质粒pCIA P免疫Wistar大鼠 ,观察重组表面蛋白抗原PAc在大鼠体内不同组织中的原位表达以及免疫定菌鼠后的防龋效果。方法 重组质粒pCIA P经股四头肌肌肉注射和颌下腺区皮下注射两种途径免疫大鼠 ,以免疫组化技术观察重组蛋白PAc在免疫部位的表达。采用股四头肌肌肉注射、颌下腺区皮下注射和颊粘膜下注射 3种方法免疫定菌鼠 ,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平 ,Keyes计分法评估免疫定菌鼠后鼠磨牙的患龋情况。结果 大鼠股四头肌细胞中可见PAc蛋白不均匀的受限表达 ,双侧颌下腺组织均可检测到PAc蛋白的阳性染色 ,在导管内表达呈强阳性。用重组质粒pCIA P经颌下腺区皮下注射和颊粘膜免疫的方法可显著增加唾液中抗PAc IgA水平和血清中特异性抗PAc IgG水平。重组质粒免疫定菌鼠后能显著降低定菌鼠龋损计分。特别是颌下腺区皮下和颊粘膜注射免疫组 ,大鼠牙本质龋的破坏程度明显低于其他组。结论 重组质粒pCIA P是一种有效的免疫原 ,粘膜免疫是较理想的DNA防龋疫苗的接种途径。

转基因番茄防龋疫苗急性和亚慢性毒性试验

为评价表达致龋变异链球菌表面蛋白和霍乱毒素B亚单位的转基因番茄防龋疫苗的安全性,进行了大鼠经口灌胃染毒试验。结果表明,急性毒性试验中大鼠均未见毒性症状,急性毒性LD50>20 g/kg;亚慢性毒性试验中大鼠均未见毒性症状,在血液学和生化、脏器系数和组织病理学检查中,试验组大鼠与阴性对照组间均无显著差异(P>0.05)。说明,表达致龋变异链球菌表面蛋白和霍乱毒素B亚单位嵌合体蛋白的转基因番茄防龋疫苗对大鼠安全。

编码基因pac的DNA疫苗经鼻粘膜免疫定菌鼠的研究

目的 检测pCIA PDNA防龋疫苗经鼻粘膜免疫定菌鼠的效果 ,并对两种不同的载体系统进行对比。方法 将 30只出生后 2 0d断乳的SD雌鼠随机分为 6组 ,制备定菌模型。分别用裸DNA(A组 )、DNA Dosper复合体 (B组 )、DNA Bupivacaine复合体 (C组 )、pCI质粒 (D组 )及无菌水 (E组 )经鼻粘膜免疫大鼠 ,裸DNA股四头肌注射 (F组 )为阳性对照。 2周后加强免疫 1次。 70d鼠龄时收集唾液、血清及粪便 ,酶联免疫吸附实验检测特异性抗体 ,处死大鼠进行Keyes记分 ,单因素方差分析法分析结果。结果 B、C、F组血清特异性抗PAcIgG水平和B、C组唾液中特异性抗PAcIgA抗体水平明显高于其他组 (P <0 0 1 )。疫苗免疫组龋齿记分明显低于阴性对照组 (P <0 0 1 ) ,其中B、C组效果最好。结论 编码基因pac的pCIA PDNA防龋疫苗经鼻粘膜途径进行免疫可以有效预防龋病的发生 。

含变链菌SBR基因的双启动子质粒pCN-SSIE的构建及其免疫原性检测

目的:构建含有编码变形链球菌致龋毒力因子SBR基因的双启动子防龋DNA疫苗pCN-SSIE,以减毒沙门菌为载体进行高效黏膜免疫。方法:通过PCR扩增编码变形链球菌表面蛋白抗原的唾液结合区段(SBR)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,将SBR基因插入到双启动子表达载体pCMVnir中,在SBR基因上游和下游依次插入人工合成的tPA信号肽基因序列、核糖体内部进入位点(IRES)基因和EGFP基因,构建质粒pCN-SSIE。通过DNA测序和酶切分析证明,双启动子表达质粒pCN-SSIE构建成功后,再用该质粒转化减毒沙门菌SL3261和转染CHO细胞,检测SBR在原核细胞和真核细胞中的表达状况,最后用pCN-SSIE裸质粒通过肌内注射免疫小鼠,检测其血清中的抗SBR特异抗体。结果:DNA测序和酶切分析均证明,构建的双启动子表达质粒pCN-SSIE开放读码框架正确;质粒在原核和真核细胞中均能正常表达;在免疫小鼠的血清中检测到了高水平的抗SBR特异IgG。结论:构建成功双启动子表达质粒pCN-SSIE,在体外真核和原核细胞中均能正常表达,用其作为DNA疫苗免疫动物,可诱导明显的免疫应答。

基因重组乳链球菌防龋疫苗主动免疫防龋研究 Ⅱ 皮下注射免疫孕兔的实验研究

目的：了解基因重组乳链球菌防龋疫苗皮下注射免疫孕兔的抗龋效果。方法：通过酶联免疫吸附检测法分析孕兔免疫前后血清、唾液和乳清中抗变形链球菌表面蛋白抗原的抗体水平。结果：腮腺和乳腺周围区域皮下注射免疫１周～２周后血清ＩｇＧ型特异性抗体、唾液和乳清ＩｇＡ型特异性抗体均有明显升高。结论：基因重组乳链球菌ＨＬ１０７具有变形链球菌表面蛋白抗原的免疫原性。

可生物降解聚合物载体微球口服防龋疫苗免疫效果

【目的】以PAc多肽(301～319)作为抗原,PBLG-PEG-PBLG做载体制备防龋微球疫苗,口服免疫SD大鼠,观察其对变链菌在大鼠牙面的黏附及对龋病发生的影响效果。【方法】28只出生30d的雄性SD大鼠随机分成4组建立龋模型,对各组大鼠口腔中变链菌的黏附菌落计数,根据Keyes评分标准做龋齿记分。【结果】PAc多肽抗原微球疫苗口服组的变形链球菌数为(13.2±8.16)×104CFU/ml;磨牙龋齿Keyes计分为31.8±6.77,均显著低于对照组(P<0.01)。【结论】口服PAc多肽抗原微球防龋疫苗均能减少龋模型大鼠龋齿的发生,以光滑面龋的减少更显著。

转基因植物表达质粒中SBR基因的序列分析

【目的】对转基因植物表达质粒 pROP1中含SBR基因P1片段 ( 1 84～ 1 946bp)进行序列测定和分析。【方法】从E .coliDH5α中提取质粒 pROP1 ,用PCR测序试剂盒和DNA自动测序仪检测P1片段的序列 ,并与GenBank上的变形链球菌表面蛋白基因序列比较 ,检测其准确性。【结果】测定了P1片段 5′端 6 1 6个碱基序列和 3′端 46 6个碱基序列 ,其准确性达98%。【结论】PCR扩增的P1片段 5′端和 3′端的DNA序列与变形链球菌表面蛋白 pac基因唾液粘附区相一致 ,为转基因番茄防龋疫苗的研究提供了基础资料。

减毒鼠伤寒沙门菌防龋疫苗的免疫防龋效果

【目的】采用减毒鼠伤寒沙门菌S .typhimuriumSL32 6 1(pET 17b/A)防龋疫苗经不同途径免疫定菌大鼠 ,观察其对变形链球菌在大鼠牙面黏附、龋病发生的影响等免疫防龋效果。【方法】将 5 0只大鼠随机分组 ,经口服、皮下、黏膜下途径免疫 ,接种变形链球菌并给予致龋饲料。对各组大鼠口腔中变形链球菌的定居菌落进行计数、黏附率计算 ,收集大鼠颌骨标本 ,根据Keyes评分标准作龋齿计分统计。【结果】口服活菌苗 S typhimuriumSL32 6 1(pET 17b/A)组变形链球菌数为(3 4± 1 4)× 10 4 CFU ;磨牙龋齿Keyes计分总和为 30 7± 6 0 ,均明显低于其它组 (P <0 0 5 )。【结论】口服S typhimuriumSL32 6 1(pET 17b/A)活菌苗可抑制变形链球菌黏附于牙面 ,并能减少龋病发生 ,具有较好的防龋效果。