DNA/RNA提取及处理方法对评价沉积物中纤毛虫分子多样性的影响

环境DNA(eDNA)技术结合高通量测序已广泛应用于评价微型生物多样性与群落构成。相较于eDNA,RNA在环境中易降解,环境RNA(eRNA)可更准确地反映群落近期生命活性状态。理论上,基于eRNA检获的生物多样性要低于eDNA检获的总体多样性。但前期已发表研究显示同一站点eDNA获得的多样性低于eRNA检获量,推测可能原因包括:1)样本量不同;2)RNA中存在DNA污染。为验证假设,本研究以陆架区2个站位沉积物中的纤毛虫为实验对象,系统性比较4种DNA/RNA提取方法:DNA直接提取(0.9 g沉积物),大样本量DNA直接提取(2 g),DNA洗脱法(2 g),RNA直接提取法(2 g);以及3种RNA提取后的处理方法:无DNA酶反转录,含DNA酶反转录,先纯化RNA再反转录。研究结果表明,大样本量(2 g)DNA直接提取法所检获的可操作分类单元(OTUs)约为小样本量(0.9 g)的2倍。相同样本量下,DNA洗脱法检获的OTUs最多,而DNA直接提取检获的OTUs低于有/无DNA酶反转检获的数量,先纯化再反转录所获得OTUs最少。就群落构成而言,DNA洗脱法和RNA纯化可有效降低浮游类群比例,可更真实展现底栖群落的构成。综上,建议使用DNA洗脱法评价沉积物中微型生物的总体多样性;采用eRNA研究具有生命活性的生物群落时,反转录之前可纯化RNA,以获得更加准确的具有生命活性的群落信息。

核酸分析方法在土壤微生物多样性研究中的应用

土壤微生物多样性一般包括微生物分类群的多样性、遗传(基因)多样性、生态特征多样性和功能多样性。传统的分离培养方法和土壤微生物的生化研究手段具有一定的局限性,核酸分析方法为土壤微生物多样性研究注入了新活力。本文主要综述了近年来国内外研究土壤微生物多样性所采用的核酸提取方法及核酸分析方法。重点阐述了基于PCR的分子指纹技术、核酸杂交技术、基因芯片等核酸分析方法的原理、优缺点和应用。各种土壤微生物多样性研究方法的综合应用可扬长避短,起到相互补充的作用,从而能够提供更加丰富而准确的土壤微生物群落结构及种群丰度变化等方面的信息,也将成为这一领域今后的发展趋势。