核蛋白TAR DNA/RNA结合蛋白43与小鼠肌萎缩侧索硬化症的关系

目的利用HB9启动子构建小鼠脊髓运动神经元特异表达人类TAR DNA/RNA结合蛋白43(hTDP-43)突变转基因小鼠,建立肌萎缩侧索硬化症(ALS)疾病模型,探究hTDP-43突变导致ALS发生的机制。方法体外构建HB9启动子连接突变hTDP-43载体,通过原核注射制备并筛选阳性转基因小鼠品系(Q331K位点和M337V位点突变各8~10只)。通过步态分析、转棒疲劳仪实验和悬挂实验检测小鼠运动能力;通过免疫组织化学法、免疫荧光染色和Western blotting分别检测hTDP-43、磷酸化hTDP-43(p-hTDP-43),Caspase-3、剪切Caspase-3(cleaved Caspase-3)、泛素蛋白、β-微管蛋白Ⅲ(Tuj1)、Ki67和细胞周期依赖性激酶5(CDK5)蛋白的表达情况。结果脊髓运动神经元表达突变hTDP-43蛋白的转基因小鼠双后肢向躯干侧回缩,运动机能随月龄增加呈现进程性减退。转基因小鼠脊髓运动神经元可见hTDP-43,p-hTDP43,Caspase-3,cleaved Caspase-3阳性染色和泛素蛋白阳性包涵体,体外分离培养脊髓胸腰段运动神经元发现hTDP-43和泛素蛋白共定位于胆碱乙酰基转位酶(ChAT)阳性的运动神经元,并伴随CDK5异位表达。结论小鼠脊髓运动神经元表达突变的hTDP-43蛋白,可促使分化的成熟神经元重新进入细胞周期,导致ALS发生。

TAR DNA结合蛋白43在肌萎缩侧索硬化症中致病机制的研究进展

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种主要累及上、下运动神经元的神经系统退行性疾病。TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)蛋白是大部分ALS患者中特征性的病理性聚集蛋白。TDP-43蛋白致ALS的机制尚不明确,可归纳为以下两种假说:"功能缺失"和"功能获得"。相关机制有:①TDP-43蛋白稳态与自噬密切相关;②TDP-43蛋白与RNA结合,干扰RNA代谢,并与应激颗粒的形成密切相关;③TDP-43蛋白聚集与线粒体功能障碍相互影响;④TDP-43蛋白异常聚集影响细胞骨架结构,致轴突运输异常,并引起神经肌肉肉接头功能障碍;⑤外泌体能降解胞浆TDP-43蛋白聚集并促进其在细胞之间的扩散等。本文就TDP-43蛋白致ALS的机制的最新进展做一综述。

TARDNA结合蛋白-43和肉瘤融合／脂肪肉瘤转运蛋白与两种神经系统变性疾病关系的研究进展

神经系统变性疾病是一类由神经元变性和继发性脱髓鞘引起的慢性病,近来研究显示TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)和肉瘤融合/脂肪肉瘤转运蛋白(FUS/TLS)与肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶痴呆(FTD)有关。与TDP-43和FUS/TLS相关的基因突变可导致其蛋白表达异常,进而引起细胞骨架蛋白降解和RNA代谢障碍。TDP-43和FUS/TLS相关ALS与FTD的病理学表现也具有相似的形式。虽然TDP-43与FUS/TLS之间的相互作用尚不清楚,但可以推测与二者相关的神经系统变性疾病可能具有相同的发病机制。

TAR DNA结合蛋白43的表达与脑损伤的相关性研究进展

TAR DNA结合蛋白43(TAR DNA-binding domain protein 43,TDP-43)是一种高度保守、广泛表达的核蛋白。如今发现TDP-43在大多数神经退行性疾病如阿尔茨海默症患者中表达,为神经退行性疾病相关的标记蛋白。本文从目前国内外的研究现状出发,围绕TDP-43的表达与脑损伤的相关性,在对TDP-43生物学特性认识的基础上,着重探讨TDP-43在急、慢性颅脑损伤中的特殊表达与作用,从而探索TDP-43在法医病理学中确定死亡原因、判定致伤致残情况的可行性。

肌萎缩侧索硬化症患者骨骼肌神经末梢中磷酸化TAR DNA结合蛋白43和泛素的表达

目的:检测肌萎缩侧索硬化症(ALS)患者骨骼肌神经末梢中磷酸化TAR DNA结合蛋白43(p TDP-43)和泛素(Ub)的表达情况,探讨其在ALS发病中的作用机制。方法:收集30例ALS患者及22例对照的骨骼肌标本,采用免疫组化法检测p TDP-43及Ub的表达情况。结果:ALS组、对照组p TDP-43、Ub阳性表达率分别为46. 7%、0. 0%和60. 0%、0. 0%,差异有统计学意义(P <0. 001)。结论:骨骼肌神经末梢是部分ALS患者除神经元及神经胶质细胞以外的p TDP-43病理沉积部位,可能参与了ALS的发病。

叶酸对肌萎缩性侧索硬化症线虫TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)毒性的改善作用

为探讨叶酸添加对TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)毒性导致的肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)治疗方面产生的作用,本文选用转入人TDP-43的转基因秀丽隐杆线虫作为受试生物,探究不同浓度叶酸(0.01 mmol/L、0.025 mmol/L、0.05 mmol/L)干预对线虫的寿命、生殖能力、瘫痪率、头部摆动频率、捕食能力与学习记忆能力的影响。结果显示,与对照组相比,0.025mmol/L组和0.05mmol/L组线虫寿命分别提高了22.48%和11.92%;0.025 mmol/L组线虫的生殖能力增加了25.26%;0.01mmol/L组和0.025 mmol/L组线虫的瘫痪率分别降低了20.19%与37.62%;0.025 mmol/L组线虫头部摆动频率在叶酸干预后的第2、4、6 d分别提高了17.14%、32.88%和39.18%;三个干预组线虫的捕食能力分别提高了24.58%、60.30%和15.85%,学习记忆能力也分别提高了36.84%、57.89%和31.58%,上述结果均具有统计学差异(p<0.05)。而且,与0.01 mmol/L组和0.05 mmol/L组比较,0.025 mmol/L组线虫的瘫痪率显著下降,其他指标均显著增加,差异有统计学意义(p<0.05)。以上结果表明,叶酸添加改善了ALS线虫中h TDP-43蛋白引起的毒性效应,并且0.025 mmol/L浓度的叶酸可能是ALS线虫最佳的干预剂量。

siRNA沉默染色质解旋酶DNA结合蛋白1对卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的:探究siRNA沉默染色质解旋酶DNA结合蛋白1(CHD1L)对卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移及相关分子如核因子κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶(MMP)的影响。方法:将si-CHD1L、si-NC质粒转染至卵巢癌HO-8910PM细胞,命名为si-CHD1L组、si-NC组,以未经转染细胞作为对照组,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞CHD1L mRNA表达; CCK-8法检测细胞增殖抑制情况;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室系统检测细胞迁移、侵袭能力;蛋白免疫印迹(WB)检测NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达。结果:与对照组、si-NC组比较,si-CHD1L组细胞CHD1L mRNA表达降低(P<0.05),细胞增殖抑制率升高,细胞迁移能力降低,迁移、侵袭数量降低(P<0.05)。与对照组、si-NC组相比,si-CHD1L组NF-κB、MMP-2、MMP-9蛋白表达降低(P<0.05)。结论:siRNA沉默CHD1L能够抑制卵巢癌HO-8910PM细胞增殖、侵袭、迁移,并能抑制NF-κB、MMP蛋白的表达,为卵巢癌的靶向治疗提供一定的理论依据。

用酵母单杂交系统筛选人IL-2Rα基因NIRS元件结合蛋白的cDNA

目的筛选与白细胞介素2受体(IL2R)α基因NIRS元件相互作用的结合蛋白。方法采用酵母单杂交体系从HTLV1转化的人外周血淋巴细胞MATCHMAKERcDNA文库中筛选与NIRS相互作用的蛋白。结果经过筛选并排除假阳性后有9个阳性克隆仍保持His+表型和βgal活性;测序后分析发现它们分别属于4个不同蛋白的cDNA克隆。其中一个是已知的反式作用因子Ku抗原,另一个是RNA聚合酶Ⅰ的转录终止因子。它们的C末端分别含有SAP和SANTDNA结合结构域。结论在Jurkat细胞中存在与NIRS元件相互作用的结合蛋白,相关的研究正在进行中。

酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨TP的生物学功能.方法酵母双杂交相关实验材料购自美国Clontech公司,其中pACT2为人肝配合表达的cDNA文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为HLA024AH.pGBKT7-53和pGADT7-T中的p53和大T抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam中的Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照.含有AF384372 HBV DNA P全基因组cDNA的质粒G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存.TP基因的上下游引物序列分别为:5'-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTTA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点.引物合成及DNA测序由上海博亚公司完成.用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP片段,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞AH109并在其内表达,挑取在SD/-Trp培养基上的转化子-即pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×109个细胞/ml),与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187配合,生长6～18 d后把长出的＞2 mm的酵母集落,在铺有X-α-gal的QDO培养基上检查α-gal活性,蓝色菌落为真阳性集落.挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的SOB平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序.提交GenBank分析.结果成功得到47个与TP特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein).筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP糖基转移酶1家族多肽A9;CD14抗原;β糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素E亚基;Z蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆RP11-107P7;RNA聚合酶Ⅱ亚单位hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白L链.19个假设蛋白的同源性在97%～100%.结论TP蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能.

长链非编码RNA在急性肺损伤中的作用及分子调控机制研究进展

急性肺损伤(ALI)是临床上常见的危重症之一。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的非蛋白质编码RNA,在染色质形成、转录和转录后翻译等基因表达水平直接或间接参与ALI的发生发展。lncRNA核富集丰富转录物1、lncRNA HOX转录反义基因间RNA及lncRNA牛磺酸上调1等lncRNA可作为竞争性内源RNA,与miR-26a-5p、miR-17-5p及miR-34b-5p等微小RNA结合,调节Wnt1诱导的信号通路蛋白1、Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1蛋白及自噬相关蛋白等下游相关蛋白的表达,参与ALI的发生发展。LncRNA可能通过调控DNA甲基化、组蛋白修饰,在表观遗传水平参与ALI的发生发展;L通过组装转录激活因子和抑制因子,调节白细胞介素6(IL-6)、IL-17、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3/9等蛋白质的转录,在转录水平参与ALI的发生发展;与多种RNA结合蛋白相互作用,在转录后水平调控ALI的发生发展。

RNA结合蛋白对神经发育和神经性疾病的影响

RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)指导着细胞体内RNA的剪接、运输、翻译和降解,从而直接调控着蛋白质的时空表达。RBPs对神经元的发育和其功能的维持是不可或缺的。本文总结了RNA结合蛋白结构和功能上的共性,以FMRP,hnRNP K,TDP-43为例,具体阐述了其对于神经元轴突、树突发育的影响以及当蛋白功能突变或缺失引起的相关神经性疾病的机理,以期为神经发育和退行性疾病的研究提供新的思路和目标。

TDP-43蛋白与运动神经元病

运动神经元病是以运动系统受累为主要临床表现的神经系统变性病,其发病机制迄今未明。TARDNA结合蛋白43(TDP-43)是近年发现的运动神经元病的特征性病理沉积蛋白,广泛出现在非超氧化物歧化酶1突变的运动神经元病患者中。这一异常蛋白的发现不仅成为神经系统变性病新分类的依据,而且也为运动神经元病致病机制的研究提供了新途径。先就TDP-43蛋白在运动神经元病中的病理改变、相关基因异常及其在运动神经元病发病中的意义做一综述。

骨桥蛋白对骨关节炎软骨细胞缺氧诱导因子-2α mRNA表达的影响

[目的]本研究探讨在体外实验中，骨桥蛋白（OPN）对缺氧诱导因子-2α（HIF-2α）在软骨细胞表达的影响，揭示OPN在骨关节炎（OA）发病中的作用机制。[方法]从OA患者胫骨表面切取软骨，并在体外培养纯化软骨细胞。用重组人类骨桥蛋白（rhOPN组）和小干扰RNA（siRNA组）对软骨细胞进行干预（对照组不予激活及干预），检测HIF-2αmRNA表达的变化。用抗-CD44单克隆抗体检测可能的配体-受体的相互作用。通过实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）同时定量软骨细胞OPNmRNA和HIF-2αmRNA的表达。[结果]rhOPN组与对照组相比，HIF-2αmRNA的表达水平显著降低，相反，siRNA组HIF-2αmRNA表达增加。同时，CD44抗体可以抑制0PN对HIF-2αmRNA的表达的影响。[结论]OPN可能通过CD44的相互作用，抑制0A软骨细胞HIF-2αmRNA的表达，从而发挥对0A的保护性作用。

利美尼定促进肌萎缩侧索硬化相关蛋白质TDP-43降解的研究

目的探索利美尼定(RIL)对肌萎缩侧索硬化(ALS)相关蛋白质TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)降解的影响.方法用瞬时转染的方法在运动神经元样细胞系NSC-34中过表达WT TDP-43,与家族型ALS相关的Q331K TDP-43、M337V TDP-43突变蛋白、TDP-43的两种C末端片段TDP-25和TDP-35,再给予利美尼定干预16h,通过蛋白印迹方法检测5种TDP-43的表达水平.结果在自噬诱导剂RIL的作用下,两种突变TDP-43及其C末端片段的表达明显减少,而WT TDP-43的蛋白质表达水平无明显变化.在自噬阻断剂3-MA的干预下,RIL降解异常蛋白质的作用也被阻断.结论RIL可经由自噬通路降解Q331K TDP-43、M337V TDP-43及其C末端截短片段.

病理性TDP⁃43蛋白在常见神经系统变性疾病患者杏仁核中的表达变化

目的总结病理性TDP⁃43蛋白在常见神经系统变性疾病中的检出率、形态特征及沉积程度,并探讨其病理学意义。方法回顾收集1994年1月至2019年9月在解放军总医院第二医学中心住院治疗并行尸检的15例病例的脑组织标本,包括5例阿尔茨海默病、3例帕金森病、2例进行性核上性麻痹和5例正常脑老化,行HE染色、卢卡斯快蓝染色、Gallyas银染,以及磷酸化TDP⁃43抗体、β⁃淀粉样蛋白抗体、AT8抗体、α⁃突触核蛋白抗体免疫组化染色,光学显微镜下观察病理性TDP⁃43蛋白病理学特征,并采用半定量法对病理性TDP⁃43蛋白沉积进行分级。结果磷酸化TDP⁃43抗体染色阳性见于5/15例老年脑组织杏仁核,包括2例阿尔茨海默病、1例帕金森病、2例正常脑老化。其中,2/5例阿尔茨海默病杏仁核可见以神经元胞质包涵体为主的重度病理性TDP⁃43蛋白沉积和轻度短神经营养不良线丝;1/3例帕金森病杏仁核罕见神经元胞质包涵体和短神经营养不良线丝;2/5例正常脑老化杏仁核可见罕见或轻度神经元胞质包涵体和短神经营养不良线丝;而2例进行性核上性麻痹杏仁核磷酸化TDP⁃43抗体染色呈阴性;15例均未见杏仁核长神经营养不良线丝,帕金森病、进行性核上性麻痹和正常脑老化均未见胶质细胞胞质包涵体和神经元核内包涵体。结论病理性TDP⁃43蛋白在阿尔茨海默病杏仁核的沉积程度最严重,可加速阿尔茨海默病认知功能下降或降低认知功能障碍阈值。

外阴鳞癌组织MDM2 mRNA和p53蛋白表达及其意义

目的 :探讨外阴鳞癌组织中MDM2mRNA和p5 3蛋白的表达及在外阴鳞癌发生、发展中的作用。方法 :采用RT PCR法检测 31例外阴鳞癌组织中MDM2mRNA表达情况 ,利用免疫组化S P法检测p5 3蛋白的表达 ,并与 31例癌旁正常外阴组织进行对照。结果 :在外阴鳞癌组织中MDM2mRNA表达率为 2 2 6 % ,明显高于对照组 ,P <0 0 5。MDM 2表达与组织分化程度无关 ,P >0 0 5。外阴鳞癌组织中p5 3蛋白表达阳性率为 5 8 1 % ,明显高于对照组。突变型p5 3在低、中、高分化外阴鳞癌组中的表达率分别为 87 5 %、6 4 3%及 2 2 2 % ,其表达率随着分化程度的降低而升高 ,低分化组中的表达率明显高于高分化组 ,P <0 0 5。MDM2基因扩增与p5 3蛋白表达呈正相关 ,P <0 0 5。结论 :MDM2基因过表达是外阴鳞癌发生、发展过程中较常见的分子事件 ;p5 3基因突变在外阴鳞癌发生、发展中起重要作用。检测p5

TDP-43在男性不育中的研究进展

全世界大约有10%~15%的育龄夫妇婚后1年不孕不育。在不育的原因中,男性因素大约占50%。男性不育病因复杂多样,很多目前尚不能明确。近年来,RNA结合蛋白在男性不育中的作用引起人们的关注。反式激活应答DNA/RNA结合蛋白(TDP-43)是一种DNA/RNA结合蛋白,参与睾丸组织中的基因调控,其异常表达可影响男性生育能力,导致男性不育。TDP-43在正常精子与异常精子中的分布与表达量也是不同的,可能是一种男性不育的标志物。本文主要就TDP-43的结构及其在男性不育中的作用进行综述。

大鼠脑缺血再灌注后TDP-43的表达变化

目的:观察脑缺血再灌注(I/R)后反式激活应答脱氧核糖核酸结合蛋白43(TDP-43)在脑内的定位及表达变化,探讨脑缺血后神经功能退变与TDP-43间的关系。方法:建立大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型。通过免疫组化方法检测I/R脑组织中TDP-43的表达变化,观察脑缺血后TDP-43与神经细胞的关系;提取I/R区组织蛋白以免疫印迹法对TDP-43的表达水平进行检测。结果:Sham组TDP-43主要定位于神经元胞核内,I/R后皮质、海马及纹状体在1、3和7 d组的TDP-43阳性细胞数量增多,出现病理性TDP-43的表达; TDP-43蛋白表达水平增高,在3 d组达高峰(P <0. 05)。结论:大鼠I/R后能导致TDP-43表达上调,且病理性TDP-43主要出现于变性的神经元中,可能与脑缺血后出现的神经退行性变有密切关系。

血清miRNA复发分子标志物检测与鼻咽癌复发远处转移的相关性

目的探讨血清miRNA复发分子标志物检测与鼻咽癌患者出现复发远处转移相关性。方法选取病理确诊的鼻咽鳞癌患者60例行8 Me V高能X射线调强放射治疗和奈达铂联合氟尿嘧啶的化疗方案。治疗结束后每3个月对患者随访1次。随访29~65个月,经MRI和病理检测25例没有发生远处转移和复发(未复发转移组),35例发生远处转移或复发(复发转移组),应用miRCURY LNATMmicroRNA Arrays芯片对血清内miRNA差异性表达谱筛查,免疫组织化学检测患者肿瘤组织内Jab1与Akt1表达情况。结果 miRNAs芯片结果显示,治疗前复发转移组比未复发转移组血清内miRPlus E1253的表达量上升,miR-125b、miR-22、miR-26b、miR-29a、miR-665和miR-720的表达量下降(均P<0.05)。治疗后复发转移组比未复发转移组血清内miRPlus E1072的表达量上升,miR-26b、miR-122、miR-30c、miR-29b、miR-550、miR-143、miR-720和let-7c的表达量下降(均P<0.05)。未复发转移组患者肿瘤组织内Jab1与Akt1蛋白阳性表达率均低于复发转移组(均P<0.05)。Logistic回归分析显示,治疗前血清miR29b、miR125b表达量和Jab1、Akt1阳性表达为患者复发转移独立危险因素(均P<0.05)。结论血清miR-125b、miR29b水平及肿瘤组织内Jab1与Akt1阳性表达与鼻咽癌患者远处转移或复发相关。

Long non-coding RNA在前列腺癌中的研究

LncRNA的本质是RNA,是由核苷酸组成的长链,有以下几个优势:(1)可以轻松与同源DNA/RNA序列结合;(2)可以折叠成复杂的二级结构,轻松与多种蛋白质结合。也就是说,LncRNA情商极高,与上层领导(DNA)关系暧昧,与同事(RNA)关系很铁,与下属(蛋白质)关系紧密。