靶向核定位序列siRNA对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA复制的抑制作用

目的针对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区设计并化学合成2条小干扰RNA(siRNA),观察其对共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)水平的影响。方法将siRNA转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞,转染后72 h,采用ELISA方法检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量,采用Real-time PCR定量检测细胞内cccDNA及细胞培养上清HBV DNA拷贝数。RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果。结果靶向NLS区的2条siRNA均能不同程度地降低HepG2.2.15细胞cccDNA水平,抑制HBV DNA的复制及HBeAg的分泌,对cccDNA的抑制率分别为93.30%和85.00%(P<0.01),对HBV mRNA抑制率分别为62.80%和48.90%,对HBV DNA抑制率分别为76.56%和66.41%(P<0.01),对HBeAg抑制率分别为57.25%、43.48%(P<0.01)。而无关序列对HBV DNA与cccDNA的复制和HBeAg表达几乎无干扰作用。结论靶向HBV核心蛋白C末端核定位序列的siRNA可特异、高效、稳定地显著降低HBV cccDNA水平,抑制HBV DNA复制及HBeAg分泌,为应用RNA干扰治疗HBV感染奠定了一定基础。

骨肉瘤p21^(WAF1/CIP1)基因DNA序列分析及其mRNA、p21蛋白表达

【目的】通过检测骨肉瘤组织中p21WAF1/CIP1基因的表达及其DNA序列变化,探讨它们与骨肉瘤生物学特性之间的关系及其对预后的评价。【方法】采用原位杂交及免疫组化法检测45例人骨肉瘤p21WAF1/CIP1基因mRNA及p21蛋白的表达。采用PCR-SSCP方法检测骨肉瘤p21WAF1/CIP1基因DNA变化。采用双脱氧核苷酸末端终止法进行DNA的直接测序。【结果】①p21蛋白表达阳性率在骨肉瘤中为18%(8/45);②p21WAF1/CIP1基因mRNA表达阳性率在骨肉瘤中为42%(19/45);③DNA序列分析结果显示,骨肉瘤中p21WAF1/CIP1基因第三外显子(exon3)的cDNA全长序列的609位碱基处发生C→T改变,发生率为47%(17/36)。exon2a的cDNA全长序列的187位、303位碱基处发生G→T改变,发生率为6%(2/36)。exon2b的cDNA全长序列的522位碱基处发生G→A改变,发生率为2.7%(1/36)。【结论】①随着骨肿瘤恶性度的升高,p21WAF1/CIP1基因mRNA及p21蛋白的表达下降。②p21WAF1/CIP1基因mRNA在骨肉瘤中的表达对预后有影响。③本实验对中国人群骨肉瘤p21WAF1/CIP1基因DNA多态性位点进行了新的定位,这些位点可能会对今后对该基因的研究提供有意义的参考。

利用染色质免疫共沉淀测序研究Twist1结合的靶DNA序列

目的:利用染色质免疫共沉淀测序研究Twist1结合的靶DNA序列,比较过表达Bcl-2和正常状态下Twist1结合靶DNA序列的变化。方法:筛选常态表达Twist1的肝癌细胞系,分别转染Bcl-2表达质粒和对照空载体,收集转染后细胞以甲醛交联DNA,收集样品进行染色质免疫共沉淀,获得与Twist1蛋白结合的DNA片段进行测序分析。结果:通过对5种肝癌细胞系进行筛选,观察到HepG2可表达Twist1,其与DNA结合序列在空载体对照组和Bcl-2过表达组具有很大的差别,结合DNA数量分别为68条和212条,其中共享序列154条。结论:Twist1在不同环境下与DNA结合位点多达212个,涉及粘附分子、细胞骨架、信号转导、代谢和转录调节等多种生物学功能。

基于靶序列循环及DNA长距自组装的电化学传感器用于乳腺癌相关序列c-erbB2的检测

基于"核酸外切酶(ExoⅢ)辅助靶序列循环"和"DNA长距自组装"两种信号放大技术研制了一种DNA电化学生物传感器,并将其用于乳腺癌相关靶序列的高灵敏、高特异性检测。通过将发卡型探针固定在金电极表面,当靶序列存在时,在ExoⅢ的辅助下,发生杂交、酶降解、再杂交的第一重信号放大过程。接着在电极表面加入两条辅助探针,即可发生级联式杂交,形成长距超级"三明治"DNA结构。该结构可吸附大量的电活性分子六氨合钌配合物(RuHex),产生很强的电化学信号,从而实现信号的第二重放大。实验结果表明,在最佳条件下,该传感器的线性范围为10 amol/L^10 pmol/L,检出限达到8 amol/L,而且能较好地识别完全互补和错配序列,有望用于临床实际样本中超低含量靶序列的检测。

不同物种间胰岛素及其编码mRNA,DNA序列比较与分析

通过PSI BLAST搜索与人类胰岛素原 (含有 86个氨基酸 )相似的蛋白质序列 ,并进行比对 ,计算比对矩阵的相似得分和期望值 ,同时运用ClustalW算法对不同物种编码前胰岛素原mRNA及其翻译的蛋白质和DNA序列进行多重比对 .结果发现 ,脊椎动物的胰岛素蛋白质一级结构 (A链和B链 )和mRNA非常相似 ,但部分动物C肽的部分序列有差异 ;系统进化分析表明 ,人和猴、小鼠和大鼠编码胰岛素的mRNA在进化上关系相近 .各物种间编码相同氨基酸的核苷酸序列 (CDS)相同 ,但编码胰岛素的DNA序列不同 .各物种胰岛素原蛋白质序列中 ,A链和B链序列保守 ,C肽有一定的差异 ;

基于Smad7基因为靶序列的RNA干涉作用研究

为了探讨小干涉RNA(siRNA)对靶基因Smad7mRNA表达的阻断作用,采用体外转录方法制备Smad7基因的小干涉RNAs(siRNAs),用脂质体介导瞬时转染BERP35T 2肺癌细胞系,并采用Northernblot杂交检测靶基因mRNA的表达丰度。结果表明,根据Smad7编码区序列在体外成功地制备了针对2个不同靶序列的siRNAs;Northernblot杂交显示,在转染siRNA的BERP35T 2细胞中,不管是内源性的还是外源性的,Smad7mRNA的表达丰度均明显下降。说明Smad7基因编码区中542563bp及701722bp2个区域均是siRNA作用的有效靶序列,本研究设计并制备的siRNAs能有效抑制Smad7基因的表达。

基于smad7基因为靶序列的RNA干涉作用研究

本文旨在探讨小干涉RNA(siRNA)对靶基因Smad7mRNA表达的阻断作用。用体外转录方法制备Smad7基因的小干涉RNAs(siRNAs),脂质体介导瞬时转染BERP35T-2肺癌细胞系,Northemblot杂交检测靶基因mRNA的表达丰度。根据Smad7编码区序列在体外成功地制备了针对两个不同靶序列的siRNAs,Northemblot杂交显示,在转染siRNA和BERP35T-2细胞中,不管是内源性的还是外源性的Smad7mRNA的表达丰度均明显下降,Smad7基因编码区中542bp～563bp及701bp～722bp两个区域均是siRNA作用的有效靶序列;本研究设计并制备的siRNAs能有效抑制smad7基因的表达。

DNA核靶向序列的研究进展

DNA核靶向序列(DNA nuclear targeting sequence,DTS)是指能够促进外源质粒DNA通过核孔复合体(Nuclear Pore Complex,NPC)靶向入核的DNA片段。筛选和发现有活性的DTS,并将其插入质粒载体中,对于在不分裂细胞中采用非病毒介导的基因转移方法所开展的基因治疗的效率的提高,具有重要科学意义。该文综述了DNA核靶向序列的发现及其作用机制,并展望了其应用前景。

RNA与DNA序列存广泛差异

据Li M 2011年5月19日（Science,2011 May 19.[Epub ahead of print]）报道,美国宾夕法尼亚大学医学院及北卡罗来纳州立大学医学院的研究人员发现RNA与DNA序列之间存在广泛的差异,这表明信使RNA有可能将遗传信息从细胞DNA携带至蛋白质加工厂的过程中以某种未知的机制进行了重新编辑。

反基因策略及其靶序列的选择

反基因策略及其靶序列的选择刘定燮，王昌才，黄建生（第一军医大学分子生物学研究所，广州５１０５１５）关键词三链ＤＮＡ，反基因策略合成的脱氧寡核苷酸在一定条件下可缠绕于ＤＮＡ双螺旋的大沟内并以氢键与其相互作用形成三链ＤＮＡ结构。一般把这类能形成三链结构的...

高产DHA海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10脂肪酸的组型及其18S rDNA序列分析

采用松花粉垂钓法分离到一株 Docosahexaenoic acid (DHA)高产菌 FJN 10。该菌株长链高度不饱和脂肪酸的组成为DHA(43.2%)和花生酸(17.5%)。高密度培养获得 33.0 g/L生物量。该菌株生活史中有营养细胞、孢子囊和孢囊胞子。对其 18S rRNA基因进行了克隆测序,并登录 GenBank(AY773276)。依据18S rRNA 基因建立的系统进化树分析表明:该菌与 Thraustochytrium sp. CHN 和 Thraustochytrium spMBIC11092具有紧密的亲源关系。

X染色体的DNA序列结构不同于6、7、8、10、11、12号染色体(英文)

雌性哺乳动物X染色体上的大部分基因均因X染色体失活作用而失去表达能力 ,X染色体长臂表现失活更明显。虽然对X染色体失活的许多方面都有所了解 ,但是仍然不清楚失活信号沿着X染色体全长扩散的机制。为了了解X染色体是否有不同于其他染色体的基因组学特征 ,这些特征是否关系到X染色体的失活扩散和维持 ,分析 6、7、8、1 0、1 1、1 2号染色体和X染色体DNA序列 7碱基 (7nt)组合水平的结构是否显示差异。从NCBI基因库(http :∥www .ncbi.nlm .nih .gov genome guide)下载 7条染色体长臂各 6 0Mb区域。将这 6 0Mb区域分为 0 5Mb (或 5 0kb)一段 ,对每一段DNA做 7nt字符串组合分析 ,如 1～ 7,2～ 8,3～ 9…… ,记录每种 7nt字符串的频率 ,A、C、G和T4个硷基的 7nt字符串共有 4 7=1 6 384种组合。根据数字差异显示的结果 (http :∥www .ncbi.nlm .nih .gov genome guide) ,选择在扁桃腺生发中心B细胞中高表达的基因 70个 ,用以计算所有内含子 (有义链 )的 7nt频率值。每个内含子被记录为一组 7nt频率值 ,求和相同基因中的所有内含子相同 7nt字符串的频率值 ,再用该和乘以该基因的表达频率得该基因 7nt字符串的频率值 ,求和 70个基因的 7nt字符串的频率值称做intron 7nt,该值试图模拟细胞中RNA小片段的总和。?

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段,并进行序列分析。 方法 根据文献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患者血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段,纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子,并导入大肠杆菌JM1019;阳性克隆经双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。 结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp;阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段;测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比,未发现碱基的插入或缺失去,同源性为99.3％;第353位碱基由C取代了G,第371位碱基由T取代了c,其余序列相同。 结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段,该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。

c-myc靶向siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的:设计构建重组体为转染肿瘤细胞,观察癌基因的沉默效果,为探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础。方法:以c-myc为靶基因,以pEGFP-C1/U6质粒为载体,设计构建重组体,根据c-myc癌基因cDNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列,克隆到空载体pEGFP-C1/U6中,转化DH5а菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。结果:经酶切鉴定筛出的重组体测序结果与目的序列相同,重组载体构建成功。结论:利用RNAi技术可成功构建小干扰RNA重组体。

非编码DNA序列的功能及其鉴定

非编码DNA序列是指基因组中不编码蛋白质的DNA序列。这些序列可以结合调节因子、转录为功能性RNA、单独或协同地调节生理活动和病理过程。文章围绕基因表达调控作用,总结了近几年非编码DNA序列的研究成果,对其结构、功能和可能的作用机制进行了初步阐述,介绍了目前鉴定非编码DNA序列中功能元件的计算方法和实验技术,并对非编码DNA未来的研究进行了展望。

DNA和RNA的结构基因组学研究的应用前景

人类基因组计划的实施产生了大量的基因数据,如何利用这些数据是后基因时代生物学研究的主要内容。结构基因组学就是利用这些数据和计算机模拟技术建立模型来为人类服务。介绍了DNA和RNA的结构基因组学的主要研究内容和进展,讨论了结构基因组学的商业应用前景。

一种简便经济制备银染序列分析模板质粒DNA的方法

用改良碱裂解法提取的质粒DNA,经RNA酶消化后做银染列分析的模板,所得测序结果清晰、准确,从而使银染法模板的制备更加经济简便。

黑曲霉T21 glaA 5’上游调控区的两个蛋白结合因子及其靶序列

采用凝胶阻滞法从糖化酶高产株黑曲霉(Aspergillus niger)T21部分纯化的蛋白提取液中检测到与糖化酶基因(glaA)5＇cis调控区特异结合的两个蛋白因子,其一的靶DNA定位在glaA翻译起始点(ATG)上游-580～-509及-318～-254bp两个区域,另一蛋白因子的靶DNA定位在-809～-580区域.-580～-509序列含有“TATA”的重复结构,-318～-254序列富含“GC”以及-809～-580序列含有CCAAT的特点暗示此3片段及其所结合的蛋白因子在A.niger T21 glaA的表达调控中可能有重要作用.

BRCA1基因全长mRNA序列分析技术

目的:建立BRCA1基因全长mRNA序列测定方法。方法:根据文献和GenBank(U14680)报道的BRCA1基本序列设计6对特异性引物,建立6个特异性逆转录PCR(RT-PCR)技术,分段且扩增BRCA1全长mRNA,然后采用毛细管电泳进行cDNA测序,方法建立后用于3名健康女性样本。结果:6个特异性RT-PCR反应扩增片段相互覆盖,使序列分析结果包括全长BRCA1mRNA,共5000多bp。3名经PCR技术检测确定携带正常BRCA1基因的样本的mRNA分析结果显示,其BRCA1mRNA序列均与过往报道的正常mRNA序列完全一致。结论:所建立的RT-PCR特异性结合BRCA1基因,能用于其mRNA全长序列分析。

DNA序列改变或可帮助解决胃癌诊断治疗难题

来自新加坡国立大学癌症科学研究所的研究人员发现RNA序列发生改变可能影响胃癌发展。对这一胃癌驱动力的研究或将促进胃癌早期诊断技术以及有效治疗手段的开发。相关研究结果发表在国际学术期刊Gastroenterology上。