溶血、脂肪血及保存条件对HBV DNA、HIV RNA核酸检测的影响

目的:标本溶血、脂肪血、不同保存条件对于血液HBV DNA、HIV DNA核酸检测结果的影响。方法:使用罗氏检测试剂,分别在4℃、25℃、37℃、-30℃下保存的12-30倍LOD浓度HBV DNA与HIV DNA标本,标本在4h、24h、48h、72h、1周通过6混样模式进行核酸检测,溶血标本Hb浓度范围分别为97g/L、34g/L、17g/L、8g/L、5g/L、3g/L,TG浓度范围分别为7.93mmol/L、3.80mmol/L、2.63mmol/L、1.83mmol/L、1.49mmol/L,1组如溶血正常对照样本进行核酸检验。结果:HBV DNA检测的血液样本,保存在温度37℃环境下,放置72h与1周测定循环阈值Ct要明显比其他的时间段高(P<0.05);溶血与脂肪血标本,表现为Hb的浓度处在97g/L状态,在HBV DNA、HIV DNA无法检出,而脂肪血的标本,TG的指标在≤7.93mmol/L以内范围,在各项检测的结果上均为未见明显的差异(P>0.05)。结论:罗氏检测试剂对血液标本中HBV DNA、HIV DNA核酸检验,若是常温下进行放置,能够在4周内任意时间进行相关指标测定,不会影响结果的准确性,同时Hb<34g/L,TG≤7.93mmol/L时对于核酸检测的结果无明显影响。

不同浓度HBV DNA和HIV-1 RNA对多重PCR检测HCV RNA的干扰验证分析

目的探讨多重聚合酶链式反应(PCR)技术在献血者血液标本中不同浓度HBV DNA和(或)HIV-1 RNA对低浓度HCV RNA检测结果的影响。方法采用阴性血浆对HCV RNA标准物质、已定量的HBV DNA和HIV-1 RNA血浆进行稀释,配制成2种病毒或3种病毒的混合液,HCV RNA浓度稳定在20.4 IU/mL[该PCR检测系统95%平均检测下限(LoD)的3倍],HBV DNA浓度为20 IU/mL、200 IU/mL、2000 IU/mL和(或)HIV-1 RNA浓度为50 copies/mL、500 copies/mL、5000 copies/mL的混合液,同时设置对照组(只有3×LoD的HCV RNA溶液),模拟献血者血液样本,分别在Roche Cobas s201核酸检测系统进行单检模式和混样模式(与5个阴性标本混合)至少检测20次,统计分析不同浓度病毒核酸检测Ct值差异以及单检模式与混检模式的漏检率。结果不同浓度HIV-1 RNA和(或)HBV DNA在单检模式下对HCV RNA检测的Ct值差异无统计学意义(P>0.05);HCV RNA在单检模式下的Ct值中位数36.60(36.20,37.10)明显低于混检模式的Ct值39.30(38.60,40.00)(P<0.05),10个分组中HCV RNA在单检模式的漏检率均为0%,而在混检模式的平均漏检率为12.62%,差异有统计学意义(P<0.05);此外,浓度20 IU/mL的HBV DNA进行单检的漏检率为7.55%,进行混检的漏检率为81.4%;50 copies/mL的HIV-1 RNA和20.4 IU/mL的HCV RNA在单检时漏检率为0%,而混检漏检率分别为28.57%和12.62%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同浓度HBV DNA和HIV-1 RNA对多重PCR检测HCV RNA结果无影响,但弱阳性HCV RNA、HBV DNA和HIV-1 RNA标本在单检模式下的漏检率低于混检模式,为提高血液安全,血液核酸检测应尽可能采用单检模式。

中国HIV-1流行毒株的DNA疫苗的初步研究

为研制针对我国HIV 1流行毒株的艾滋病毒疫苗 ,构建了具有代表性的 gag和 gp12 0核酸疫苗 ,进行了初步的小鼠免疫实验。结果初步显示 :(1)免疫Balb/C小鼠可以产生HIV 1特异性的体液和细胞免疫 ;(2 ) gag和gp12 0基因联合免疫可以同时诱发针对 gag和 gp12 0的细胞和体液免疫反应 ,而且效果比各自单独免疫要好 ;(3)B亚型 gp12 0基因免疫可以诱发识别C亚型 gp12 0抗原的CTL反应。本文核酸疫苗研究的初步结果值得进一步系统地进行试验。

治疗性HIV-1重组DNA疫苗的构建与免疫效果评价

目的 构建编码HIV- 1多表位抗原基因 (MEG)与p2 4基因嵌合的核酸疫苗 ,并评价其免疫效果。方法 将编码HIV -1多表位抗原基因 (MEG)与p2 4基因插入到真核表达载体pVAXI中 ,构建HIV- 1治疗性重组核酸疫苗质粒。通过ELISA试剂盒检测免疫恒河猴血清中HIV -1特异性抗体 ,并通过淋巴细胞转化实验检测HIV -1特异性T淋巴细胞增殖反应。结果 构建的重组核酸疫苗质粒pVAXI -MEGp2 4免疫恒河猴后 ,能有效地刺激产生T淋巴细胞特异性增殖反应 ,并诱导产生抗HIV -1特异性抗体。结论 所构建的重组核酸疫苗质粒能诱导机体产生免疫反应。

HIV流行毒株的DNA macroarray基因分型技术的研究

目的:建立一种特异、相对简便的H IV流行毒株基因分型新技术。方法:从H IV-1抗体阳性标本中提取H IV前病毒DNA,使用H IV-1型共用引物进行PCR扩增。同时设计一条型特异性的探针,然后通过制作DNA m acroarray芯片,鉴别样本的H IV亚型。结果:DNA m acroarray分析可以检测我国H IV主要流行株基因型的特异性序列:B、C、CRF01-AE和CRF07-BC。结论:DNA m acroarray方法对H IV亚型进行分析是可行的,可以在H IV流行病学调查中应用。

滤纸片干血斑用于HIV-1 DNA检测的评价

目的探索滤纸固定艾滋病病毒Ⅰ型核酸(HIV-1 DNA)的稳定性、均一性,评价滤纸片干血斑HIV-1DNA检测方法的敏感性、特异性。方法套式PCR扩增HIV-1的env、gag、pol三区。不同环境条件下保存的滤纸片干血斑,分别在不同的时间段检测;滤纸片干血斑的中心及圆斑的上下左右4个边缘,随机打取5个2.5mm圆片用于检测。采自新疆现场的94份阴性样本和90份阳性样本,分别制成滤纸片干血斑样本和全血样本,比较两者的HIV-1DNA检测结果。结果滤纸片干血斑-20℃或4℃放置1年或室温放置3个月,或在37℃放置两天或冻融2次,实验的敏感性未见下降;37℃放置3天或冻融3次,已经有样本不能检出。滤纸干血斑不同位点随机打取圆片扩增,4个样本中,中点均阳性,但在上点、左点、右点分别出现一份阴性结果。滤纸干血斑法和全血法检测HIV-1前病毒DNA比较,敏感性是96.1%,特异性是98.9%。结论滤纸干血斑在室温条件下运输是可行的,推荐尽量靠近滤纸干血斑的中间位点打取圆片扩增;该方法操作简便、经济、敏感、特异。

滤纸片干血斑HIV-1 DNA检测方法的建立

目的探索用滤纸片作血液样本的载体,建立一种简单、经济、敏感的滤纸片干血斑艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)DNA检测方法。解决HIV-1感染者全血样本采集、运输和储存过程中存在的实际困难。方法首先用滤纸片FTA卡收集血液制成滤纸片干血斑,处理提取DNA后,针对HIV的env、gag、pol区,设计三对高度保守引物,套式PCR扩增HIV-1 DNA。进一步用HIV-1质粒DNA检测该方法的最低检测限。结果摸索出扩增滤纸片干血斑HIV-1 DNA的最佳扩增条件;滤纸片干血斑样本pol区最低检测限是6拷贝/μl,env区8拷贝/μl,gag区10拷贝/μl。结论可以用滤纸片FTA卡收集HIV-1感染者的血液,制成滤纸片干血斑后检测HIV-1 DNA。该方法操作简便、经济、敏感,建议作为HIV-1抗体检测的辅助诊断方法。

基于纳米ZnO/壳聚糖复合膜DNA电化学传感器用于HIV基因的免标记检测

以室温固相合成法制备纳米ZnO，通过壳聚糖（CHIT）的成膜效应将纳米ZnO固定在玻碳电极（GCE）表面，制得的ZnO／cHIT／GCE电极成为DNA固定和杂交的良好平台。DNA的固定和杂交通过电化学交流阻抗进行表征。以电化学交流阻抗免标记法检测目标DNA，固定于电极表面的DNA探针与目标DNA杂交后使电极表面的电子传递电阻增大，以此作为检测信号可以高灵敏度地测定目标DNA。电化学阻抗谱检测人类免疫缺陷病毒（HIV）基因片段的线性范围为2．0×10^-11～2．0×10^-6mol／L，检出限为2．0×10^-12mol／L。

外周血HIV-1 DNA在艾滋病疗效评估中的应用

目的通过研究HIV感染者HIV-1 DNA与HIV-1 RNA及CD4^(+)T淋巴细胞间的关系,探讨外周血HIV-1 DNA在艾滋病疗效评估中的应用。方法筛选2018年6—9月贵州省贵阳市公共卫生救治中心的HIV感染者80例,采用面对面问卷调查收集患者资料,并采集患者K2EDTA抗凝血,完成CD4^(+)T淋巴细胞、HIV-1 RNA及HIV-1 DNA的检测并得出结果。通过SPSS等软件分析HIV感染者的病毒库水平,以及HIV-1 DNA与HIV临床分期、CD4^(+)T淋巴细计数及HIV-1 RNA的相关性。结果HIV感染者CD4^(+)T淋巴细胞数量越多,HIV-1 RNA含量越低,其全血中HIV-1 DNA的水平越低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIV-1 DNA可反映抗逆转录病毒治疗(HAART)期间病毒库水平,提示疾病进展情况,评价治疗效果,可为贵州省艾滋病的治疗提供更精准的监测手段。

HIV-1 RNA被有效抑制下T细胞与外周血中HIV-1前病毒DNA

目的:考察HIV-1 RNA被有效抑制下T细胞与外周血中HIV-1前病毒DNA的相关性。方法:对云南地区90例确诊为AIDS,HAART持续治疗时间超过6个月,血浆HIV RNA<50 Copies/ml的患者进行研究,采用Spearmans秩和相关回顾性分析CD4+、CD3+、CD8+、CD4+CD28+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD38+、CD8+CD38+T细胞的绝对计数和相对计数与外周血中HIV-1前病毒DNA的相关性,同时考察HIV-1前病毒DNA拷贝数与HAART持续治疗时间的相关性。将90例患者根据HAART后CD4+T细胞绝对计数分为A(CD4+<200 cells/μl)、B(200≤CD4+≤349 cells/μl)、C(CD4+≥350 cells/μl)3组,考察3组间T细胞亚群的差别。结果:HIV-1前病毒DNA的log拷贝数与CD4+CD45RA+T细胞绝对计数呈负相关(r=-0.231,P<0.05),与CD4+CD45RA+T细胞相对计数呈明显负相关(r=-0.270,P<0.01);与CD38+T细胞绝对计数呈正相关(r=0.250,P<0.05);与HAART持续治疗时间无相关性。B、C组的CD3+T细胞绝对计数明显高于A组(P<0.01);C组的CD8+T细胞绝对计数高于B组的(P<0.05);B、C组的CD4+CD28+T细胞绝对计数和相对计数明显高于A组(P<0.01),C组的CD4+CD28+T细胞绝对计数高于B组(P<0.05);B、C组的CD4+CD45RA+T细胞、CD4+CD45RO+T细胞绝对计数明显高于A组(P<0.01),C组的CD4+CD45RA+T细胞、CD4+CD45RO+T细胞绝对计数高于B组(P<0.05),B、C组的CD4+CD45RO+T细胞相对计数高于A组(P<0.05);B、C组的CD8+CD38+T细胞绝对计数低于A组(P<0.05),B组的CD8+CD38+T细胞相对计数低于A组(P<0.05);C组的CD38+T细胞绝对计数高于A组(P<0.05)。A、B、C组的HIV-1前病毒DNA的log拷贝数分别为3.561±0.297 9,3.605±0.277 6,3.434±0.289 1(copies/ml),3组间无显著性差异(P>0.05)。结论:经过HAART治疗后HIV-1前病毒DNA可能处于稳定状态,HIV-1前病毒DNA拷贝数只是某些T细胞亚群数量改变的原因之一。

HIV感染的治疗性DNA疫苗(综述)

DNA疫苗被称为继完整病原体疫苗和基因工程重组蛋白疫苗后的第 3代疫苗 ,其兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗的有效性。HIV感染的防治则以激发细胞免疫为主 ,以激发细胞免疫为主的DNA疫苗给HIV感染防治带来曙光。目前DNA疫苗在HIV感染防治研究方面已取得显著进展 ,其临床研究已证明具有明显的刺激机体细胞免疫的效果 ,尤其是一些细胞因子、趋化因子可明显增强HIVDNA疫苗的免疫反应。就DNA免疫佐剂、HIV病毒基因DNA疫苗作用机制以及加强HIVDNA疫苗的各种调节因素方面的研究进展进行概述 ,以促进HIVDNA疫苗防治的研究。

利用PCR法检测HIV—1 DNA

通过比较多个HIV(人免疫缺陷病毒)分离株的核苷酸序列,我们选择膜基因上7373—7514位的一段保守区为目的片段合成了引物1(5′—AGCAGCAGGAAGCACTATGGGC—3′)和引物2(5′—CCAGACTGTGAGTTGCAACA—3′),并分别以质粒PⅢexE7和MT4-HIV-1 DNA,为模板进行了PCR反应及敏感性试验。结果表明,用PCR法可检测出1～10个质粒分子及1×10~6个细胞中一个感染细胞。因此我们推论,本法可应用于AIDS临床标本的检测。

HIV-1 Tat蛋白抑制DNA修复和增强细胞辐射敏感性

近年来临床研究发现,艾滋病合并肿瘤患者放疗后产生的正常组织和皮肤毒性反应明显高于普通肿瘤患者.本研究将探讨HIV-1Tat蛋白是否影响细胞对电离辐射敏感性及机理.两个表达Tat蛋白的细胞系TT2和TE671-Tat均来源于人的横纹肌肉瘤细胞(TE671)并已转染了不同来源的tat基因.使用细胞辐射后克隆形成率检测辐射敏感性,RT-PCR和Western印迹检测基因表达,彗星电泳和γ-H2AX位点检测DNA双链断裂和修复.TT2和TE671-Tat细胞的辐射敏感性与转染空载体及对照细胞相比明显增加.彗星电泳和γ-H2AX位点检测表明,在表达Tat蛋白的细胞中,辐射诱导DNA双链断裂的修复水平明显降低.通过RT-PCR和Western印迹检测进一步证实,表达Tat蛋白的细胞中DNA修复蛋白DNA-PKcs的表达被抑制.HIV-1Tat蛋白抑制DNA-PKcs的表达,降低DNA双链断裂的修复,使细胞的电离辐射敏感性增高.本研究为了解AIDS合并肿瘤患者对放射治疗敏感性变化提供了重要信息.

用分子对接方法研究HIV-1整合酶与病毒DNA的结合模式

用分子对接方法研究了HIV-1整合酶(Integrase,IN)二聚体与3′端加工(3′Processing,3′-P)前的8bp及27bp病毒DNA的相互作用,并获得IN与27bp病毒DNA的特异性结合模式.模拟结果表明,IN有特异性DNA结合区和非特异性DNA结合区;IN二聚体B链的K14,R20,K156,K159,K160,K186,K188,R199和A链的K219,W243,K244,R262,R263是IN结合病毒DNA的关键残基;并从结构上解释了能使IN发挥活性的病毒DNA的最小长度是15bp.通过分析结合能发现,IN与DNA稳定结合的主要因素是非极性相互作用,而关键残基与病毒DNA相互识别主要依赖于极性相互作用.模拟结果与实验数据较吻合.

IL-18和HIV-1gag-gp120嵌合基因DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答

目的 :探讨IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫小鼠的免疫应答。方法 :构建含IL 18的真核表达质粒pVAXIL18,将他与表达HIV 1gag gp12 0嵌合基因的核酸疫苗质粒pVAXGE共同肌注免疫BALB/c小鼠 ,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体滴度。结果 :联合免疫组小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平均显著高于单独免疫组 (P <0 .0 5 ) ,空白质粒对照组 (P <0 .0 1)和PBS对照组 (P <0 .0 1)。结论 :IL 18和HIV 1gag gp12 0嵌合基因的DNA疫苗联合免疫可诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫 ,且IL 18发挥了免疫佐剂的作用。

HIV-1感染者免疫活化对宿主限制因子SAMHD1表达和HIV-1 DNA水平的影响

目的研究HIV-1感染者CD4;T细胞免疫活化与外周血宿主限制因子SAMHD1表达水平和HIV-1 DNA的关系。方法选取未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者57例,接受抗病毒治疗且病毒载量低于检测限的HIV-1感染者62例,健康对照48例。分离外周血单个核细胞(PBMC)和CD4;T细胞,提取总RNA,RT-PCR法检测SAMHD1 mRNA表达水平及血浆HIV-1 RNA水平,流式细胞术检测CD4;T和CD8;T细胞数量及CD4;T细胞免疫活化水平,ELISA检测血浆干扰素α水平,PCR法检测外周血HIV-1 DNA水平。结果未接受抗病毒治疗的HIV-1感染者CD4;T细胞免疫活化水平最高,抗病毒治疗组显著降低,但仍高于健康对照组(P <0.01)。未接受抗病毒治疗组外周血HIV-1 DNA水平显著高于抗病毒治疗组(P <0.01)。HIV-1感染者PBMCs中SAMHD1 mRNA水平显著高于健康对照组(P <0.01),而CD4;T细胞中SAMHD1 mRNA表达水平显著低于健康对照组(P <0.01)。CD4;T细胞SAMHD1 mRNA表达水平与免疫活化呈负相关,但与HIV-1 DNA水平无相关性。结论 HIV-1感染者CD4;T细胞SAMHD1表达水平降低,与免疫活化水平负相关,但与HIV-1 DNA水平无直接相关。

IL-18DNA免疫对HIV-1核酸疫苗诱导的免疫应答的影响

为了研究白细胞介素-18(IL-18)基因对人免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸疫苗诱导免疫应答的影响,将人IL-18基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达载体pVAX1-IL-18;将pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18或者pCI-neoGAG单独免疫Balb/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体和IFN-γ,同时观察免疫小鼠脾淋巴细胞增殖和小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。酶切及测序结果表明成功地构建了人IL-18基因真核表达载体;与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的抗HIV-1p24抗体滴度降低(P<0.01);而与pCI-neoGAG免疫组比较,pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠血清的IFN-γ升高(P<0.01);pCI-neoGAG联合pVAX1-IL-18免疫组小鼠的脾淋巴细胞增殖实验刺激指数(SI)以及特异性CTL活性均高于pCI-neoGAG免疫组(P<0.01)。IL-18基因联合HIV-1核酸疫苗免疫小鼠,可能增强特异性Th1细胞和CTL反应,白细胞介素-18基因对体液免疫有抑制作用。

HIV-1表面糖蛋白gp120 DNA疫苗质粒的构建与表达

目的 构建含HIV-1表面糖蛋白基因的真核表达质粒,并在Hela细胞内表达。方法 在核酸疫苗载体质粒 pVAX1中插入gp120基因,构建真核表达质粒pVAXGP。在体外用脂质体法将重组质粒转染Hela细胞,并用间接免疫荧光试验、免疫印迹试验和Dot-ELISA对表达产物进行检测。结果 间接免疫荧光试验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹试验和Dot-ELISA结果均显示,重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gp120蛋白。结论 已成功地构建了真核表达质粒,且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。

电喷雾质谱法研究聚酰胺、酰亚胺衍生物与HIV-1基因DNA的相互作用

利用电喷雾质谱(ESI-MS)研究了6种识别分子与HIV-1基因调控区DNA的非共价键相互作用.在研究中比较了不同识别分子与靶序列DNA结合的强弱,发现双萘酰亚胺衍生物4对此序列DNA具有高亲合性的结合,并分析了识别分子与DNA复合物的碎裂机理以及结合模式.

HIV-1复制型DNA疫苗与非复制型重组痘苗病毒疫苗在小鼠体内细胞免疫效果的研究

目的:用HIV-1复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗(rNTV-C)进行单独免疫和联合免疫的研究(2种疫苗分别包含HIV-1 B'/C亚型的gp160、gag-pol、rev-tat-nef等6种基因),以了解这2种新型HIV疫苗单独免疫及联合免疫的效果,并为临床免疫方案的制定提供实验依据。方法:将HIV-1 DNA疫苗和rNTV-C疫苗免疫BALB/c小鼠,设计rNTV-C单独免疫组、DNA单独免疫组,以及DNA初免、rNTV-C加强的联合免疫组,并设计不同免疫途径和不同剂量的各种组合。用IFN-γELISPOT检测各组的细胞免疫效果,用统计学方法分析比较各组细胞免疫效果的差异。结果:DNA疫苗和rNTV-C疫苗单独免疫时,二者都能诱发针对各抗原的特异性免疫反应;联合免疫能够诱发比DNA或rNTV-C单独免疫都强的特异性细胞免疫反应。统计分析显示,2种疫苗采用肌肉注射途径的免疫效果显著高于皮内注射,1μg和5μg DNA疫苗的免疫效果差异不显著,而1×108 PFU的rNTV-C比2×107PFU的免疫效果要强。结论:联合免疫策略能够显著增强HIV-1疫苗各抗原的免疫原性,通过对2种HIV-1疫苗单独免疫及二者联合免疫的细胞免疫反应的分析比较,确定了较好的免疫方案,为疫苗临床前免疫效果评价和临床方案的制定提供了实验依据。