敲低DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)抑制Bel7402/5-Fu耐药肝癌细胞的细胞周期及机制

目的研究DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)基因沉默后对Bel7402/5-氟尿嘧啶(5-Fu)肝癌耐药细胞的细胞周期及机制的影响,探讨DNA-PKcs影响化疗敏感性的相关机制。方法采用MTT法检测Bel7402/5-Fu细胞转染siDNA-PKcs后,对5-Fu、阿霉素(ADM)的敏感性;采用阳离子脂质体法将siDNA-PKcs寡核苷酸片段转染Bel7402/5-Fu细胞;流式细胞术检测细胞周期;Western blot法检测细胞P21、细胞周期蛋白B1(cyclin B1)、细胞分裂周期蛋白2(CDC2)的蛋白表达情况;实时定量PCR检测细胞毛细血管扩张共济失调突变基因(ATM)、p53的mRNA水平,Western blot法检测细胞ATM、P53蛋白水平。结果敲低细胞DNA-PKcs水平后,siDNA-PKcs组5-Fu、ADM的半数抑制浓度(IC50)明显降低,S期细胞减少、G2/M期细胞增多,细胞周期抑制因子P21蛋白水平增加,cyclin B1、CDC2蛋白水平降低,ATM、p53的mRNA及蛋白水平增加。结论敲低DNA-PKcs水平,增加P21蛋白水平,同时抑制cyclin B1、CDC2蛋白水平,诱导Bel7402/5-Fu细胞G2/M期阻滞,其机制可能与ATM-p53信号途径有关。

慢性髓系白血病DNA依赖蛋白激酶催化亚基基因的研究

本研究旨在探讨髓系粒细胞白血病(CML)的DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)基因表达水平、调控机制及其在CML急性变中的作用。用半定量RT-PCR、Western blot方法分别检测62例CML患者及K562细胞的DNA-PKcs mRNA和DNA-PKcs蛋白表达,并与23例正常人作对照;对26例接受同种异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)及4例使用伊马替尼治疗的CML患者用RT-PCR、Western blot方法分别动态检测bcr-abl mRNA和DNA-PKcs蛋白表达水平;用伊马替尼体外作用CML患者的单个核细胞(MNC)及K562细胞后,用RT-PCR、Western blot方法分别检测DNA-PKcs mRNA和DNA-PKcs蛋白表达及bcr-abl融合蛋白的酪氨酸磷酸化水平。结果表明:与正常人比较,CML患者及K562细胞的DNA-PKcs蛋白表达量明显降低(P<0.05);26例allo-PBSCT及4例使用伊马替尼治疗的CML患者,DNA-PKcs蛋白表达量随着bcr-abl mRNA表达量的降低而升高;伊马替尼体外作用于CML患者MNC及K562细胞后,DNA-PKcs蛋白表达量随着bcr-abl融合蛋白酪氨酸磷酸化水平的降低而升高。结论:bcr-abl融合基因通过转录后机制下调DNA-PKcs蛋白的表达;DNA-PKcs蛋白表达下降可能是CML急性变的机制之一。

DNA依赖蛋白激酶催化亚基与细胞周期蛋白T2相互结合的鉴定

目的鉴定与DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNAPKcs)相互结合的蛋白,以深入探讨其生理功能。方法通过免疫共沉淀获得DNAPKcs的相互结合蛋白复合物,SDSPAGE电泳分离蛋白,肽质指纹分析和Western印迹鉴定蛋白。结果以DNAPKcs抗体进行免疫共沉淀从HeLa细胞中获得DNAPKcs的相互结合蛋白,对部分结合蛋白进行质谱分析和蛋白数据库检索,发现转录延伸因子PTEFb的亚基细胞周期蛋白(cyclin)T2是其中之一。其后,通过Western印迹检测,进一步证实DNAPKcs与cyclinT2相互结合作用。结论首次发现DNAPKcs与cyclinT2的相互结合,提示DNAPKcs参与基因转录调控或转录偶联修复反应的生物学功能。

DNA-蛋白激酶依赖蛋白激酶催化亚基在鼻咽癌中的表达及意义

目的探讨DNA-蛋白激酶依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）在鼻咽癌中的表达及其临床意义。方法选取2007年5月~2012年7月于广西壮族自治区人民医院肿瘤中心的83例鼻咽癌患者（鼻咽癌组）和32例鼻咽炎患者（鼻咽炎组）,通过免疫组织化学的研究方法分析DNA-PKcs的表达情况,并通过分层分析的方法评估DNA-PKcs与鼻咽癌临床病理学因素之间的联系,进一步分析DNA-PKcs的表达与鼻咽癌预后之间的相关性。结果鼻咽癌患者DNA-PKcs的表达明显高于鼻咽炎患者,差异有高度统计学意义（P〈0.01）;DNA-PKcs的表达水平与鼻咽癌的病理分型、临床分期、体力量表评分、年龄、性别无关（P〉0.05）;DNA-PKcs的表达水平与鼻咽癌患者的近期疗效无显著相关性（P〉0.05）;DNA-PKcs的表达水平越高,鼻咽癌患者的远期生存时间越长（P〈0.01）。结论 DNA-PKcs在鼻咽癌中高表达可以作为一个鼻咽癌预后的预测指标。

DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在非同源末端连接修复中作用的研究进展

DNA的精确复制对维持基因组稳定性具有重要作用,而DNA双链断裂(DSB)损伤可能诱导细胞凋亡和染色质重排,在肿瘤的发生发展过程中发挥作用。DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)是磷脂酰肌醇3-激酶样蛋白激酶(PIKK)家族中相对分子质量最大及表达量最高的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。与Ku70/80结合后,DNA-PKcs在离子辐射诱导DSB后的非同源末端连接(NHEJ)有效修复过程中,发挥非常重要的作用。DNA-PKcs或其他NHEJ修复因子的缺失会导致辐射敏感性和DSB的未修复,以及V(D)J重组缺陷和免疫缺陷。本文主要对DNA-PKcs的结构,在DSB位点的募集与激活,在NHEJ修复中的作用过程及其与疾病的关系进行总结与展望,希望能为DNA-PKcs的深入研究及临床应用提供理论基础。

沉默DNA依赖蛋白激酶亚基对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复功能的影响

目的探讨DNA依赖蛋白激酶亚基(DNA-PKcs)基因沉默后对肝癌耐药细胞Bel-7402/5-Fu DNA损伤修复功能的影响。方法采用阳离子脂质体法将sh DNA-PKcs干扰质粒转染Bel-7402/5-Fu细胞,根据荧光细胞数计算转染率,实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)及Western blot检测DNA-PKcs的沉默效率;Western blot检测TopoⅡ、γ-H2AX蛋白表达;5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷法检测细胞DNA合成。结果质粒的转染效率为67%;q RT-PCR及Western blot检测结果显示,DNA-PKcs m RNA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%和71.8%;Western blot结果显示,实验组TopoⅡ蛋白表达水平比对照组低,差异有统计学意义(P<0.05),γ-H2AX蛋白表达水平比对照组高,差异有统计学意义(P<0.01)。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷法结果显示,实验组DNA合成率比对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 sh DNA-PKcs干扰质粒能下调Bel-7402/5-Fu细胞中DNA-PKcs、TopoⅡ蛋白的表达,抑制Bel-7402/5-Fu细胞DNA合成。

DNA依赖蛋白激酶在Ⅰ～Ⅱ期非小细胞肺癌中的表达及意义

背景与目的Ku70基因、Ku80基因和DNA-PKcs基因是DNA双链断裂修复的主要因子。本研究的目的是探讨Ku70、Ku80和DNA-PKcs蛋白在Ⅰ～Ⅱ期非小细胞肺癌中的表达及其临床意义。方法利用组织芯片(tissue microarray,TMA)技术和免疫组织化学二步法,对86例行术后辅助化疗的早期非小细胞肺癌标本进行上述3种重组修复相关蛋白的检测。结果在肺癌组织中Ku70、Ku80、DNA-PKcs蛋白的阳性率分别为68.6%、72.1%和87.2%,其表达与临床病理类型无明显关系(P>0.05)。预后较差的患者Ku70、Ku80、DNA-PKcs的表达水平有高于预后较好患者的趋势,但其差异无统计学意义(P>0.05)。结论Ku70、Ku80、DNA-PKcs在未经化疗的肺癌组织中均有不同程度表达,其表达高低对早期非小细胞肺癌术后辅助化疗无指导意义。

乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶的表达变化

目的探讨乳腺癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)的表达变化及其意义。方法采用免疫组化SP法检测56例乳腺癌组织及50例乳腺良性病变组织中DNA-PK的3个亚基DNA-PKcs、Ku70、Ku86的表达情况,同时检测这些组织中雌激素受体(ER)及癌基因c-erbB-2的表达。结果Ku70、Ku86在乳腺癌组织中的表达明显低于乳腺良性病变组织(P<0.01),而且Ku70和Ku86的表达随乳腺癌病理分级的升高而降低,但DNA-PKcs在两者中的表达则无明显变化。Ku70与Ku86的表达在ER阳性组高于ER阴性组,在c-erbB-2阳性组的表达则低于c-erbB-2阴性组,差异均有极显著性意义(均P<0.01)。结论Ku70和Ku86的低表达在乳腺癌的发生和发展中有重要意义,且其与ER、c-erbB-2关系密切,对乳腺癌的临床治疗及预后判断有一定的指导意义。

低剂量放射超敏感性和放射拒抗与DNA依赖蛋白激酶的表达

低剂量放射超敏感性是最近十几年来研究的热点课题之一。是继放射敏感性之后的又一重大发现,是对传统放射生物学的一个有益补充和发展。有助于解决肿瘤细胞的放射耐受和正常组织的放射损伤问题。对放射治疗分割方法的设计、物理计划设计和生物学优化都具有重要指导意义。低剂量放射超敏感性主要包括放射超敏感期和放射拒抗期。放射超敏感期与细胞凋亡密切相关,放射拒抗期主要以DNA损伤修复后非同源末端连接相关,DNA-PK(DNA-PKcs、Ku70、Ku80)等蛋白参与DNA非同源末端连接,在超敏中具有重要作用。本文对DNA-PK在低剂量超敏感性中的作用做一综述。

鼻咽癌病变过程中DNA依赖蛋白激酶表达水平的相关研究

目的研究鼻咽癌病变过程中DNA依赖蛋白激酶(DNA-PKcs)表达规律。方法在鼻咽癌高发区,选择鼻咽炎患者30例、鼻咽上皮细胞不典型增生或化生患者42例及鼻咽癌患者34例作为研究对象,免疫组化检测患者鼻咽组织DNA-PKcs的表达水平。结果鼻咽炎、鼻咽上皮细胞不典型增生或化生及鼻咽癌患者鼻咽组织DNA-PKcs的表达水平分别是6.7%、64.3%、55.9%(P<0.001),依据病理分级严重程度的不同,DNA-PKcs呈现不同的表达水平。结论DNA-PKcs在鼻咽癌变过程中可能发挥一定的作用。

DNA依赖的蛋白激酶和检查点激酶1对卵巢癌细胞周期阻滞的研究

目的:探讨DNA-PK和CHK1对卵巢癌Skov3的细胞周期阻滞的机制。方法:通过对DNA-PK shRNA和CHK1 shRNA的构建及有效干扰载体的筛选,流式细胞仪检测G2期。结果:转染DNA-PK shRNA的Skov3细胞和Hela细胞经2Gy X射线照射后进入G2期的细胞比率无差异;转染CHK1 shRNA的Skov3细胞经2Gy X射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞(t=2.618,P=0.026),28h时明显低于Hela细胞(t=2.705,P=0.022);转染DNA-PK shRNA和CHK1 shRNA的Skov3细胞经2Gy X射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞(t=2.965,P=0.014),28h时明显低于Hela细胞(t=2.302,P=0.044)。结论:干扰DNA-PK和CHK1的表达可增强卵巢癌细胞对辐射的敏感性。

DNA依赖性蛋白激酶在妇科肿瘤中的研究进展

DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)是哺乳动物细胞DNA损伤修复的关键酶。研究表明,妇科肿瘤,如宫颈癌、卵巢癌中普遍存在DNA-PK表达的变化,提示该酶在妇科肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要的作用,并与肿瘤的临床分期、放射敏感性和预后有重要关系。近年来,关于DNA-PK的结构与功能、在肿瘤细胞株中的活性、在肿瘤组织中表达的研究日益深入,以DNA-PK为靶点的DNA修复抑制剂作为肿瘤放化疗增敏药已陆续研发并进入临床前试验,有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。

DNA依赖蛋白激酶生物学功能与肿瘤相关性研究进展

近年来利用现代分子生物技术检测各种肿瘤标志物和基因以探索其与肿瘤的相关性,为肿瘤综合治疗提供合理的指导已成为可能。目前,国内外有关DNA-PK的研究报道较多,本文就DNA-PK的主要生物学功能及其与肿瘤的相关研究做如下综述。

DNA依赖蛋白激酶的研究新进展

DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)是DNA损伤修复的关键酶。大量研究表明,各种恶性肿瘤中普遍存在DNA-PK表达的变化,提示该酶可作为一种肿瘤标志物,其表达水平不但与肿瘤的发生、发展有关,还与某些肿瘤的病理类型、分期及侵袭性有关,并与肿瘤放射敏感性和预后有重要关系。近年来,关于DNA-PK的研究日益深入,以DNA-PK为靶点的DNA抑制剂作为肿瘤放化疗增敏药有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。

DNA依赖蛋白激酶与切除修复交叉互补基因1在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达及意义

目的分析DNA依赖蛋白激酶(DNA-PKcs)、切除修复交叉互补基因1(ERCC1)在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达及其意义。方法采用免疫组化SP法检测65例上皮性卵巢癌、20例卵巢交界性肿瘤、18例卵巢良性肿瘤及15例正常卵巢组织中DNA-PKcs、ERCC1的表达,并分析其异常表达与卵巢恶性肿瘤临床病理特征的关系;分析DNA-PKcs与ERCC1表达的相关性。结果 DNA-PKcs在卵巢癌(66.15%)、交界性卵巢肿瘤组织(55.00%)中的阳性表达率高于卵巢良性肿瘤(11.11%)及正常卵巢(6.67%),差异有显著性,ERCC1在卵巢癌(67.69%)、交界性卵巢肿瘤组织(60.00%)中的阳性表达率高于卵巢良性肿瘤(16.67%)及正常卵巢(13.33%),差异有显著性;DNA-PKcs、ERCC1表达与残留灶大小有关,与FIGO分期、病理类型、病理分级及淋巴结转移无关;DNA-PKcs与ERCC1表达呈正相关。结论 DNA-PKcs、ERCC1表达与卵巢癌的发生发展有关,在促进卵巢癌的浸润转移过程中可能起重要作用。

小鼠蛋白激酶CK2α亚基的克隆、测序、表达及初步鉴定

背景与目的:蛋白激酶CK2是一种高度保守性的真核细胞中普遍存在的丝/苏氨酸激酶,它的活性在人的许多肿瘤细胞是升高的,可作为一种癌基因起作用。为了深入进行CK2结构与功能的研究,本研究拟构建小鼠蛋白激酶CK2α亚基cDNA重组表达质粒,并进行表达和初步鉴定。方法:通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞获得小鼠CK2α亚基编码区cDNA。将NdeⅠ/BamHI双酶切PCR产物连接到同样双酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化的表达载体pT7-7进行定向克隆。转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子,琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子,将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选4个阳性克隆进行DNA测序,将序列完全正确的重组质粒转化表达菌BL21(DE3),挑单克隆小量培养,IPTG诱导表达,Westernblot鉴定。结果:转化子的阳性筛选率为100%;限制性酶切分析结果表明,插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。DNA正反向测序结果表明:从4个阳性克隆中筛选到1个PCR过程不产生突变的重组质粒,并将其质粒命名为pTMCKA。重组质粒转化表达菌经IPTG诱导后出现一分子量42kDa蛋白过度表达,Westernblot结果证明过度表达产物能与抗人CK2α亚基抗体发生特异性免疫反应。结论:重组小鼠蛋白激酶CK2α亚基的克隆表达获得成功。

硝普钠及SOD降低大鼠心肌细胞DNA蛋白激酶二聚体和Ku70/80表达

目的观察硝普钠(SNP)及自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)对大鼠心肌细胞H9C2和心肌组织DNA-PKcs和Ku70/80表达的影响。方法体外培养H9C2心肌细胞按SNP浓度和加入的自由基清除剂SOD和CAT浓度分组;SD大鼠随机分为5组,每组8只,分别采用0.9%氯化钠溶液、SNP、SNP+SOD、SNP+CAT和SNP+SOD+CAT行腹腔注射,1周后收集心肌组织。用Western blot法检测各组细胞DNA-PKcs和Ku70/80表达,免疫组织化学法检测DNA-PKcs和Ku70/80表达。结果心肌细胞的DNA-PKcs和Ku70/80蛋白相对表达量均随SNP剂量增加呈递增趋势;加入SOD或CAT或二者合用,均显著降低DNA-PKcs和Ku70/80表达(P<0.05)。SNP组、SNP+SOD组、SNP+CAT组和SNP+SOD+CAT组大鼠心肌组织DNA-PKcs和Ku70/80表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结论自由基清除剂SOD和CAT能够通过降低心肌细胞DNA-PKcs和Ku70/80的表达拮抗NO对心肌细胞的损伤。

Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶重组腺病毒载体的构建、鉴定及初步应用

目的:构建携带Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(PKGⅡ)基因的重组腺病毒载体,并以此初步研究PKGⅡ对增殖相关的MAPK信号转导的影响。方法:将PKGⅡcDNA片段自载体pRC/CMV-GKⅡ(wt)中切出,克隆至穿梭质粒pENTR 1A,用ClonaseⅡ将pENTR-PKGⅡ中的PKGⅡcDNA片段定向克隆到pAd/CMV/V5-DEST中构建pAd/CMV/V5-DEST-PKGⅡ(Ad-PKGⅡ)。重组质粒Ad-PKGⅡ用PacⅠ酶酶切,使其线性化,再用脂质体转染法转染HEK293A细胞进行包装和扩增,微量全细胞病变法检测病毒滴度,蛋白质印迹法检测重组腺病毒Ad-PKGⅡ感染细胞后PKGⅡ的表达以及MAPK通路关键成分胞外信号调节激酶(ERK)活性的变化。结果:重组腺病毒滴度达5×109pfu/ml,蛋白质印迹法检测显示重组腺病毒感染CS54细胞后使其PKGⅡ表达明显增高;在BGC-823胃癌细胞株,PKGⅡ对EGF导致的ERK的激活有明显抑制作用。结论:成功构建了携带PKGⅡ基因的重组腺病毒,初步证明PKGⅡ对细胞增殖相关信号转导有抑制作用,为进一步研究PKGⅡ与肿瘤细胞发生发展的关系提供了基础。

重组慢病毒介导RNA干扰抑制DNA依赖蛋白激酶催化亚基表达对肺癌细胞中C225诱导表皮生长因子受体核转位及敏感性的影响

目的 构建人DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）基因RNA干扰慢病毒载体,观察在非小细胞肺癌细胞株中沉默DNA-PKcs对C225诱导的表皮生长因子受体（EGFR）核转位及C225抑制细胞增殖的影响.方法 构建慢病毒干扰载体（LV-si-DNA-PKcs）感染A549细胞.荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）检测DNA-PKcs mRNA表达;Western blot检测DNA-PKcs和细胞核EGFR蛋白的表达.细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测C225对细胞的增殖抑制作用.结果 LV-si-DNA-PKcs感染的A549细胞见绿色荧光,感染率达95％以上;LV-si-DNA-PKcs有效干扰DNA-PKcs蛋白及mRNA表达水平（P＜0.05）.加C225前未见细胞核EGFR表达.C225处理1h,LV-si-DNA-PKcs细胞株见细胞核EGFR表达,持续用药4、24 h细胞核EGFR表达无明显增加;在LV-si-control细胞株及空白组,C225处理1、4、24h后细胞核EGFR表达逐渐增多.C225处理48 h后,LV-si-DNA-PKcs细胞株的细胞存活率开始低于其他2组细胞,72 h细胞存活率明显降低[（40.04±2.89）％比（55.82±7.11）％、（52.67±1.43）％,F=9.392,P＜0.01].结论 抑制A549细胞中DNA-PKcs表达,在一定程度上抑制了C225诱导的EGFR细胞核转位,增强C225对细胞的增殖抑制作用.