DNA依赖型蛋白激酶催化亚单位在辐射诱导的DNA损伤应答中的作用

哺乳类细胞基因组DNA损伤会迅速引发DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）,这一反应涉及一系列复杂DNA损伤信号传导、分子变化和细胞学应答.有些很重要的DNA损伤反应蛋白能参与多个细胞学反应的调控,发挥交叉耦联分子的作用.DNA依赖蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）是DNA双链断裂的非同源末端连接修复途径的关键组分,属于磷脂酰肌醇3-激酶家族成员,近年来的研究发现其在DNA损伤的早期信号过程、修复、细胞周期检查点、有丝分裂调节及凋亡等一系列DNA损伤应答反应中起重要作用.本文就DNA-PKcs在DNA损伤应答中的作用机制研究进展进行了综述.

联合抑制聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1及DNA依赖蛋白激酶催化亚单位增加KG-1α细胞对依托泊苷的敏感性

目的观察联合抑制聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]及DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(catalytic sunbunit of the DNA-dependent protein kinase,DNA-PKcs)对依托泊苷(etoposide,VP-16)作用于急性髓系白血病KG-1α细胞的影响。方法分别用特异性抑制剂奥拉帕尼(Olaparib,OLA)和Nu7441(NU)抑制PARP-1、DNA-PKcs。将KG-1α细胞设置成对照组、模型组、PARP-1抑制组(PARP-1 inhibition,VP-16+OLA)、DNA-PKcs抑制组(DNA-PKcs inhibition,VP-16+NU)、联合抑制组(combined inhibition,VP-16+OLA+NU)。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法体外检测联合用药对KG-1α细胞增殖抑制的影响;用高内涵荧光成像检测分析不同处理组的γ-H2AX在DNA双链断裂断裂位点的募集情况;用蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达情况。结果对照组、模型组、PARP-1抑制组、DNA-PKcs抑制组和联合抑制组的增殖抑制率分别为(1.16±1.45)%,(23.88±3.15)%,(28.12±2.28)%,(17.21±0.89)%和(60.72±4.38)%;γ-H2AX阳性细胞百分比分别为γ-H2 AX阳性细胞百分比分别为(1.24±0.07)%,(22.51±2.24)%,(24.55±3.29)%,(23.28±2.48)%和(40.55±1.61)%;Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量分别为0.16±0.10,0.61±0.30,1.15±0.64,1.11±0.31和1.72±1.03;Cleaved PARP蛋白相对表达量分别为1.23±0.09,1.45±0.55,2.03±0.84,2.08±0.41和2.66±0.95。模型组分别与对照组、联合抑制组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论联合抑制PARP-1及DNA-PKcs能够在体外增加KG-1α细胞对依托泊苷的敏感性。

DNA-PKcs蛋白和MGMT蛋白在肝癌组织中的表达及意义

目的探讨DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在肝癌发生、发展中的作用及临床应用价值。方法应用免疫组化方法检测DNA-PKcs蛋白和MGMT蛋白在68份肝癌组织(肝癌组)和10份正常肝脏组织(对照组)中的表达情况,采用χ2检验及Spearman秩和相关检验分析结果。结果肝癌组及对照组DNA-PKcs蛋白表达阳性率分别为85%和10%,MGMT蛋白表达阳性率分别为40%和90%(P均<0.05);两者表达具有负相关性(r=-0.475,P<0.05)。结论DNA-PKcs和MGMT在肝癌发生、发展中起重要作用:有望作为肿瘤标记物、基因靶点等用于肝癌的诊治。

卵巢上皮性肿瘤组织中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表达变化及意义

目的观察卵巢上皮性肿瘤组织中DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)和调节亚单位Ku70蛋白的表达变化,并探讨其在上皮性卵巢癌发生、发展中的作用。方法采用免疫组织化学法,检测63例上皮性卵巢癌患者及20例良性上皮性卵巢肿瘤组织中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表达,分析两者表达的关系及与上皮性卵巢癌临床病理参数之间的关系。结果上皮性卵巢癌组织中DNA-PKcs、Ku70蛋白的阳性表达率均显著高于良性上皮性卵巢肿瘤(P均<0.05);其中DNA-PKcs蛋白的表达与上皮性卵巢癌病理学分级和手术病理分期相关(P<0.05),Ku70蛋白的表达与上皮性卵巢癌手术病理分期、病理学分级、腹水及淋巴结转移均相关(P<0.05),二者均与组织病理学类型无关(P<0.05);DNA-PKcs蛋白与Ku70蛋白的表达呈正相关r=0.619(P<0.001)。结论DNA-PKcs、Ku70蛋白高表达可能在上皮性卵巢癌发生、发展及转移中发挥协同作用,且有可能成为上皮性卵巢癌早期诊断、预后判断的新指标及治疗靶点。

结肠腺癌组织中DNA-PKcs的表达及临床意义

目的探讨DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)在结肠腺癌(COAD)组织中的表达特征及在COAD预后中的预测价值。方法通过GEPIA在线网站分析275例COAD组织和349例正常对照组织的DNA-PKcs表达;利用Kaplan-Meier Plotter在线网站分析DNA-PKcs表达与COAD患者(1061例)生存情况的关系。选取本院2019年1月至2021年6月行手术切除治疗的58例COAD患者为研究对象,采用免疫组化检测COAD组织中DNA-PKcs表达并分析其与临床病理特征的关系;Pearson相关分析评估DNA-PKcs表达与癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)的相关性;受试者工作特征(ROC)曲线评估DNA-PKcs、CEA、CA199对COAD不良预后的预测价值。结果在线分析提示COAD组织中DNA-PKcs的表达水平高于正常对照组织(P<0.05),且789例DNA-PKcs低表达者的中位总生存期为134个月,优于272例高表达者的106个月(P<0.05);DNA-PKcs表达在不同TNM分期、分化程度、神经侵袭、浸润深度、复发和淋巴结转移的COAD患者进行比较,差异有统计学意义(P<0.05);DNA-PKcs与CEA、CA199均呈正相关(r=0.431、0.381,均P<0.05);三者联合检测预测COAD不良预后的曲线下面积为0.876(95%CI:0.763~0.948),敏感度为0.862、特异度为0.897。结论DNA-PKcs高表达参与COAD的恶性进展,且其与CEA、CA199联合检测显著提高了对COAD不良预后的预测效能,对COAD不良预后评估具有较高的参考价值。

急性白血病患者TopoⅡα和DNA-PKcs的表达与多药耐药的关系

目的:探讨拓扑异构酶Ⅱα(TopoⅡα)和DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)在急性白血病(AL)患者中的表达及其与多药耐药的关系。方法:采用免疫组织化学SP法检测62例AL患者骨髓白血病细胞TopoⅡα和DNA-PKcs的表达。结果:1)TopoⅡα在耐药组和敏感组中阳性表达率分别为33.3%和69.0%,耐药组TopoⅡα阳性表达率明显低于敏感组(P<0.01)。2)DNA-PKcs在耐药组和敏感组中的阳性表达率分别为51.5%和20.7%,耐药组DNA-PKcs阳性表达率明显高于敏感组(P<0.05)。3)在TopoⅡα阳性表达的患者中,DNA-PKcs阳性表达组耐药率(61.5%)明显高于DNA-PKcs阴性表达组(16.7%)(P<0.05)。在DNA-PKcs阴性表达的患者中,TopoⅡα阴性表达组耐药率(61.9%)明显高于TopoⅡα阳性表达组(16.7%)(P<0.01)。TopoⅡα阳性表达DNA-PKcs阴性表达组耐药率最低(16.7%),而TopoⅡα阴性表达DNA-PKcs阳性表达组耐药率最高(90.0%)(P<0.001)。TopoⅡα和DNA-PKcs两者表达之间无相关性。结论:AL患者TopoⅡα表达水平下降,DNA-PKcs表达水平升高与临床耐药密切相关,联合检测TopoⅡα和DNA-PKcs对临床耐药和预后的判断有一定价值。

GLUT-1和DNA-PKcs在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其意义

背景与目的:已知肿瘤细胞生长所需能量是通过葡萄糖转运体蛋白1(glucose transporter protein1,GLUT-1)完成的葡萄糖代谢来提供的。另外,参与基因损伤修复的催化亚单位——DNA蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)在肿瘤形成中也起着非常重要的作用。本研究旨在探讨GLUT-1和DNA-PKcs在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其与肿瘤生物学行为的关系和意义。方法:免疫组化方法检测80例卵巢浆液性肿瘤组织中GLUT-1、DNA-PKcs的表达,分析其异常表达与临床病理参数之间的相关性,以正常卵巢组织20例为对照。结果:正常卵巢组织GLUT-1表达全阴性,DNA-PKcs表达全阳性。GLUT-1在良性、交界性、恶性卵巢浆液性肿瘤中的表达呈增高的趋势,与卵巢浆液性肿瘤的发生发展呈正相关(rs=0.943,P<0.01);

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗DNA-PKcs人源单链抗体

目的:从单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗DNA-PKcs的人源抗体,用于肿瘤治疗或诊断目的。方法:经抗原性分析及BLAST比对,选定人DNA-PKcs蛋白中抗原性高且与其他蛋白没有同源性的片段,进行原核表达及纯化后将其固定在抗原管上,通过4轮"吸附-洗脱-扩增"过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体,转化HB2151菌,制备抗DNA-PKcs的可溶性单链抗体;ELISA检测抗原-抗体结合活性。结果:经生物信息学分析,确定抗原性高且与其他蛋白没有同源性的DNA-PKcs片段DPK3(250个AA)、DPK4(257个AA)。经过4轮筛选,获得26个特异性结合DPK3及31个特异结合DPK4的克隆,指纹分析分别有5种和21种不同的可变区片段;成功制备了可溶性抗体。并做了抗原结合活性鉴定。结论:利用单链大容量抗体库获得抗DNA-PKcs的噬菌体抗体基因并且成功制备成可溶性抗体,为今后的研究和应用奠定了基础。

DNA-PKcs在铂类耐药形成过程中的动态表达及临床因素的相关性分析

目的动态检测裸鼠铂类耐药模型DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)在铂类耐药形成过程的变化,分析卵巢癌患者DNA-PKcs的表达水平与临床因素的相关性,为肿瘤患者的个体化治疗提供实验依据。方法以实时荧光定量PCR技术检测DNA-PKcs mRNA的表达;Pearson相关分析卵巢癌患者DNA-PKcs的表达量与卵巢癌患者临床因素的相关性,Kaplan-Meier法分析临床因素及DNA-PKcs的表达对患者无疾病进展生存时间和总生存时间的影响;Cox回归模型分析卵巢癌预后相关因素对患者生存的影响。结果裸鼠体内铂类耐药移植瘤DNA-PKcs的表达显著低于铂类敏感对照(P=0.003),铂类敏感细胞在获得性耐药形成过程中DNA-PKcs的表达逐渐下降,耐药细胞产生以后,DNAPKcs基因的表达始终在较低的水平。Pearson分析表明DNA-PKcs的表达与患者对铂类药物初始治疗的反应和铂类耐药的产生呈显著负相关(P=0.000)。Kaplan-Meier法分析显示,FIGO分期越早、无术后残余病灶、对铂类初次治疗有效、铂类治疗敏感、DNA-PKcs高表达的患者的生存时间显著延长(P<0.05)。Cox回归模型分析发现纳入影响卵巢癌患者总生存时间的危险因素为铂类初始治疗反应(P=0.047)和铂类耐药产生(P=0.047),铂类药物治疗完全有效和部分有效患者的DNA-PKcs表达量显著高于肿瘤无消退和肿瘤增长的两组患者(P=0.000),铂类敏感患者DNA-PKcs平均表达量显著高于铂类耐药患者(P=0.000)。结论 DNA-PKcs的表达下降与铂类耐药形成相关,可能作为判断卵巢癌铂类耐药产生的潜在标志分子。

用酵母双杂交系统鉴定DNA-PKcs磷酸化簇区域和DNA-PKcs单链抗体anti-DPK3-scFv间的相互作用

目的:构建DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)磷酸化簇区域的酵母双杂交诱饵载体及针对该区域的单链抗体anti-DPK3-scFv的猎物蛋白的表达载体,并进行活性和相互作用鉴定。方法:应用PCR方法扩增DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv并将它们分别克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7中,经酶切和测序鉴定正确后,用LiAc法转化到酵母菌株AH109中,鉴定诱饵蛋白和猎物蛋白的毒性和自激活活性,并通过酵母双杂交方法验证DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv的相互作用。结果:扩增出DNA-PKcs磷酸化簇区域和anti-DPK3-scFv并分别将它们克隆至p GBKT7和p GADT7载体中,转化酵母细胞发现它们对酵母细胞的生长均无毒害作用,自激活活性分析显示诱饵质粒和猎物质粒均无自激活活性,并证实DNA-PKcs磷酸化簇区域能够与anti-DPK3-scFv在体外直接相互作用。结论:构建了DNA-PKcs磷酸化簇的诱饵质粒p GBKT7-DPC,为后续筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白奠定了实验基础。

转录反式激活因子对DNA—PKcs启动子的调控作用

目的检测人类免疫缺陷病毒转录反式激活因子（TAT）对DNA依赖蛋白激酶催化亚单位（DNA—PKcs）基因启动子活性的影响。方法用PCR方法克隆DNA—PKcs基因启动子的系列截短体，通过DNA重组构建pGL3-basic—DNA—PKcs启动子报告质粒载体，通过双荧光素酶报告基因检测DNA—PKcs基因的启动子活性，采用基于乳糖抑制子和乳糖操纵子并结合绿色荧光蛋白分子荧光的大规模染色质松弛报告系统观察染色质的重构活性，并研究了电离辐射对TAT参与染色体重构的影响。结果构建了DNA—PKcs启动子（全长区域为-939hp--1bp）的系列截短体的报告质粒载体，鉴定出其核心区域为-64hp--1bp。TAT能够抑制DNA—PKcs基因启动子的转录活性。TAT具有大规模的染色体松弛活性，电离辐射能抑制TAT参与染色体重构的作用。结论TAT能抑制DNA修复基因DNA—PKcs的肩动子活性，电离辐射能抑制TAT参与染色体重构的作用。

应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA—PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白

目的通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位（DNA dependent protein kinase catalytic subunit，DNA—PKcs）磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证。方法通过酵母双杂交技术，以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵，在人肝组织酵母文库中筛选与DNA—PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白，对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析；构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体，分别转染至人胚。肾293T细胞中，检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达；最后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中，通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用。结果经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆，通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆，对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白，经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1。成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体，且均能够在293T细胞中正确表达。免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA—PKcs磷酸化簇区域发生相互作用。结论成功筛选到与DNA—PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证。

胆囊良恶性病变组织中DNApkcs和Ku70的表达及其临床病理意义

目的探讨胆囊腺癌、癌旁组织、腺瘤性息肉和慢性胆囊炎组织中DNApkcs和Ku70的表达水平及其临床病理意义。方法方法免疫组化法检测108例胆囊腺癌、46例癌旁组织、15例腺瘤性息肉和35例慢性胆囊炎组织中DNApkcs和Ku70的表达,分析其与临床病理因素的关系。结果胆囊腺癌DNApkcs和Ku70表达阳性率(50.0%,51.9%)明显低于癌旁组织(82.6%,82.6%)、腺瘤性息肉(80.0%,80.0%)和慢性胆囊炎胆囊上皮(91.4%,88.6%)(P<0.05或P<0.01);高分化腺癌、淋巴结未转移及未侵犯周围组织器官者DNApkcs和Ku70表达阳性率明显高于低分化腺癌、淋巴结转移及侵犯周围组织器官者(P<0.05或P<0.01),但与胆囊腺癌其他临床病理特征无明显关系(P>0.05)。胆囊腺癌中DNApkcs与Ku70两者表达呈高度一致性(χ2=48.07,P<0.01),DNApkcs和Ku70表达阳性者术后生存期明显高于阴性表达者(P<0.05)。结论 DNApkcs和Ku70表达水平与恶性肿瘤进展、生物学行为及预后有关,高水平表达者恶性度低及生存期长,DNApkcs和Ku70可能成为一个反映胆囊腺癌预后的重要生物学标记物之一。

重离子与X射线照射肺癌细胞A549的生物学效应比较

目的比较碳重离子与x射线对肺癌细胞的生物学效应。方法对A549细胞分别进行碳重离子和x射线照射，通过克隆形成实验检测照射后细胞存活情况；流式细胞术检测细胞周期分布；通过Hoechst33258荧光染料对照射后固定的细胞进行染色，计算凋亡率；采用实时荧光定量PCR方法检测照射后48h细胞内DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA—PKcs）和H2AX的mRNA表达水平。结果细胞存活曲线显示，碳重离子造成的细胞存活分数远低于x射线，并将细胞周期阻滞于G，／M期（t=4．77、14．53、14．54，P〈0．05），导致大部分细胞进入凋亡途径。碳重离子与x射线辐照后DNA．PKcs的表达上调（t=10．91、5．05，P〈0．05）。结论碳重离子照射对肺癌细胞造成生物学效应远高于x射线。