结核分枝杆菌DNA促旋酶基因突变与耐氟喹诺酮类药物的相关性研究

目的 分析MDR TB结核分枝杆菌临床分离株的DNA促旋酶（gyr）基因突变特点,初步探究MDR-TB对氟喹诺酮类药物耐药与gyr基因突变的相关性.方法 采用最低抑菌浓度（MIC）法筛选MDR-TB,对17株临床MDRTB菌株应用DNA直接测序法检测gyr基因的突变情况,分析细菌基因突变与耐药产生的相关性.结果 Mtb 1株标准菌株（H37Rv）未见gyr A亚单位基因（gyrA）和gyr B亚单位基因（gyrB）基因突变,所有17株临床菌株gyrA均存在95位AGC→ACC.12株耐环丙沙星和左氧氟沙星菌株中,10株gyrA产生了错义突变,突变率为83.3％;突变位点位于89位、90位、91位和94位;1株发生了gyrB突变,突变位点位于500位.耐莫西沙星的9株耐药株中,8株gyrA发生突变,占88.9％.结论 gyrA基因突变是Mtb对氟喹诺酮类药物产生耐药的机制之一;gyrA的错义突变主要发生在第89位、90位、91位、94位密码子上.

细菌DNA促旋酶和拓扑异构酶IV基因突变与其喹诺酮耐药性的相关性

介绍了喹诺酮类药物在细菌细胞中的作用靶位——Ⅱ型拓扑异构酶(DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ)的组成及其在细菌细胞生长过程中的作用.介绍了测定DNA促旋酶基因(gyrA、gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ基因(ParC、ParE)点突变的常用方法及分析gyrA、gyrB、ParC和ParE突变与细菌喹诺酮耐药性的相关性的常用方法.根据近年来的研究成果,以金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和大肠埃希氏菌、淋病奈瑟氏球菌为代表,概述了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中DNA促旋酶基因和拓扑异构酶Ⅳ基因突变的情况及其与喹诺酮耐药性的相关性,以及喹诺酮类药物对DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的选择性.

喹诺酮的作用方式:抑制细菌DNA促旋酶

虽然人们已十分详尽地阐明了喹诺酮类抗菌药的作用机制,但仍未能全面理解它,还有一些问题没有得到很好的解释,这需要将来作进一步研究,以便设计出更好、更合理的类似物.先概述一下拓扑异构酶和DNA促旋酶的抑制作用将有助于继续进行喹诺酮类抗菌药作用机制的讨论.现有大量知识是从对细菌和哺乳动物的拓扑异构酶Ⅰ、Ⅱ的研究中得到的,这些将在下文中陈述.

细菌促旋酶和拓扑异构酶IV非喹诺酮抑制剂的研究进展

研究表明,对细菌的复制阶段进行干扰对抑制细菌的繁殖和传播具有重要作用。其中,DNA促旋酶和拓扑异构酶IV是细菌复制所需的2个酶,是良好的抗菌药作用靶点,如喹诺酮类抗生素主要作用靶点就是DNA促旋酶(革兰阴性菌)和拓扑异构酶IV(革兰阳性菌)。然而,由于长时间、广泛的使用,细菌通过DNA促旋酶和拓扑异构酶IV作用位点的突变对喹诺酮类抗生素已产生了严重的耐药性。尽管如此,由于与作用靶酶结合位点的差异,耐喹诺酮类的致病菌对其它非喹诺酮类抗生素可能依然敏感,故有必要进行深入研究。本文概述了近5年来细菌促旋酶和拓扑异构酶IV非喹诺酮抑制剂的最新研究进展,以启迪科学家更合理的设计此类化合物。

运用PCR-RFLP技术研究耐喹诺酮类铜绿假单胞菌gyrA基因的突变

目的研究临床分离的耐喹诺酮类铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）gyrA基因突变情况。方法以铜绿假单胞菌gyrA基因序列为靶序列,用PCR-RFLP、DNA测序等方法,对铜绿假单胞菌gyrA基因突变进行研究。结果在57株耐喹诺酮类铜绿假单胞菌中,有35株（61.4%）菌gyrA基因的83位出现突变,其突变方式为Thr83（ACC）→Ile（ATC）,其余22株（38.6%）耐喹诺酮类铜绿假单胞菌未发现基因位点突变。33株喹诺酮类敏感临床分离铜绿假单胞菌菌株未发现上述突变。gyrA基因的PCR扩增产物SacⅡ酶切片段与它们测序结果一致。结论 gyrA基因83位氨基酸密码子突变（Thr-83→Ile）是临床分离铜绿假单胞菌耐喹诺酮类药物的主要机制之一。

酶促合成 造就无限未来 访天津中合基因科技有限公司董事长孙隽博士

REPorTEr's NotEs人物素描在探索生命科学的征途上,DNA(脱氧核糖核酸)的相关研究及产业应用始终是业界关注的核心焦点。1953年,DNA双螺旋结构被科学家沃森、克里克发现,至此之后的近百年间,在科学家们的共同努力下,DNA合成技术的发展已经到了可以全新设计、从头合成DNA的阶段。

香蕉枯萎和细菌性软腐病菌的多重PCR检测

香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense和细菌性软腐病菌Dickeya zeae的复合侵染为害给香蕉产业发展带来严重挑战,有必要建立相关病害的多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)检测技术。本文基于尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 1,FOC1)基因组contig 438区间(35 631-37 693 bp)(GenBank:AMGP01000438.1)和4号生理小种(F.oxysporum f.sp.cubense race 4,FOC4)基因组contig 195区间(4 028-6 126 bp)(GenBank:AMGQ01000195.1)存在160 bp插入序列差异设计特异扩增引物FOC-F/-R,同时以香蕉细菌性软腐病菌D.zeae的促旋酶B亚单位基因(the subunit B of gyrase gene)(GenBank:JQ284039)序列设计特异扩增引物gyrB-F/-R。多重PCR检测结果显示:本技术可在一次PCR扩增反应内同时检测香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种和细菌性软腐病菌;多重PCR的灵敏度结果表明:检测香蕉枯萎病菌的DNA浓度最低限为0.1 ng/μL,细菌性软腐病菌的灵敏度为103cfu/mL;检测结果稳定可靠。因此,本研究建立的多重PCR检测方法可有效应用于检测香蕉发病组织中的香蕉枯萎病菌和细菌性软腐病菌,也可用于香蕉种苗和田间土壤带病菌的监测,为香蕉种植保驾护航。

人促血管生成素-2反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人促血管生成素- 2(Ang -2)反义真核表达载体。方法应用基因重组技术将Ang 2cDNA反向克隆到真核表达载体pEGFP N1 中。结果XholI、BamhI双酶切后,反义重组基因为 5. 4kb和 0. 726kb两条带,与理论计算相符。结论成功构建人Ang- 2真核表达载体,为肿瘤细胞的Ang- 2反义基因治疗研究创造了条件。

利用磁镊研究促旋酶与DNA的结合

促旋酶(gyrase)在原核生物的生命活动中扮演着重要的角色,它是已知拓扑异构酶中,唯一能够向DNA引入负超螺旋的酶.本文中,我们利用磁镊(magnetic tweezers)对促旋酶和DNA的相互作用进行了单分子实时观测.实验发现,在不加入ATP时,促旋酶能够同时与两段DNA(G片段和T片段)结合,但这种结合较弱,施加0.7pN的外力就能逐渐破坏两者的结合;但加入高浓度的诺氟沙星后,促旋酶与DNA的结合明显增强,甚至能够抗衡5.9pN的外力.促旋酶还会影响超螺旋的几何尺度:不加入促旋酶时,DNA超螺旋的几何尺度由DNA所受拉力决定,而加入促旋酶后,超螺旋DNA几何尺度变小,并且主要由DNA与促旋酶的相互作用而不再是所受拉力所决定.而且促旋酶与正负超螺旋的结合能力不同,它更容易与正超螺旋结合.同时,发现促旋酶从DNA上解离的时间符合双指数分布.我们提出的模型能够很好地解释这个分布,并与他人提出的模型的结果进行了比较.

变性高效液相色谱法检测鲍曼不动杆菌喹诺酮耐药基因突变

目的通过运用变性高效液相色谱(DHPLC),研究鲍曼不动杆菌耐药表型与其染色体上gyrA和parC基因突变的关系。方法采用微量肉汤稀释法测定左氧氟沙星和加替沙星对90株临床分离鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(MIC);采用基因外序列进行同源性分析,PCR扩增鲍曼不动杆菌的gyrA和parC基因,对PCR产物进行DHPLC检测及DNA测序。结果 90株鲍曼不动杆菌中,对左氧氟沙星和加替沙星耐药率分别为63.3%和60.0%;同源性分析可分成9种基因型,90株扩增出了343bp的gyrA基因和327bp的parC基因产物。9种基因型中,3种表型耐药的基因型PCR产物经DHPLC检测均出现异常双峰或者多峰。测序证实gyrA基因存在83位Ser→Leu突变,parC基因在80位同样出现Ser→Leu突变,同时parC基因还存在多个位点的同义突变;敏感株运用DHPLC检测只出现单峰,测序未发现突变。结论运用DHPLC检测可以快速发现细菌耐药基因的突变,鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药与gyrA和parC基因的高频突变相关。

幽门螺杆菌对左氧氟沙星耐药的研究

背景:耐药菌株的出现是近年来药物根除幽门螺杆菌(H.pylori)成功率下降的主要原因,尤其是对常用抗生素克拉霉素和甲硝唑耐药。左氧氟沙星是一个新近用于根除H.pylori的抗生素,含左氧氟沙星的方案是有效的补救方案,但关于左氧氟沙星的耐药率以及耐药机制目前知之甚少。目的:监测H.pylori对左氧氟沙星的耐药率,观察耐药倾向,探讨可能的耐药机制。方法:对2003年在仁济医院内镜中心行胃镜检查的连续26株临床菌株行左氧氟沙星、克拉霉素和甲硝唑敏感性试验;选取8株敏感株(2株标准菌株)行左氧氟沙星体外选择耐药试验:以修饰内切酶位点的指定引物人工将HinfⅠ酶切位点引入左氧氟沙星耐药菌株(体外人工选择分离株和临床株)的聚合酶链反应(PCR)产物,然后以HinfⅠ行酶切以鉴别gyrA基因91位密码子是否存在突变。结果:左氧氟沙星的耐药率为3.8% (1/26),2株对克拉霉素耐药的菌株均对左氧氟沙星敏感。体外选择耐药试验的8侏菌株中有5株选择分离出耐药菌株,但均为低度耐药菌株。4株体外人工选择分离耐药菌株均为gvrA基因喹诺酮耐药决定区域(QRDR)中编码Asp91的密码子突变,5株临床耐药株中有4株为91位密码子突变。结论:目前H.pylori对左氧氟沙星的耐药率低,左氧氟沙星是较好的根除H.pylori方案的可选药物之一。由于体外试验较易选择出耐药,因此需监测左氧氟沙星的耐药率。gyrA基因QRDR中编码91位Asp的密码子突变在左氧氟沙星的耐药机制中占主导地位。

单耐氧氟沙星的结核分枝杆菌耐药机制研究

目的探讨单耐氧氟沙星的结核分枝杆菌中耐药相关基因突变及外排泵基因风坦两种不同耐药机制的作用。方法从国家结核病参比实验室2007年全国耐药基线调查菌株库中挑选单耐氧氟沙星的菌株17株。采用直接测序法检测利福平耐药相关基因删似和gyrB突变情况。提取gyrA和gyrB无突变菌株的RNA后反转录并采用Real—timePCR方法检测20个药物外排泵基因的表达量，对比菌株最低抑菌浓度（MIC）试验结果，筛选可能与氧氟沙星药物外排泵的相关基因，并选用大肠埃希菌为模式生物构建表达载体，检测过表达目的外排泵蛋白的大肠埃希菌对氧氟沙星的耐药程度加以验证。结果在17株单耐氧氟沙星的菌株中，有4株（4／17）检测到gyrA突变，其中包括90位点突变1株及94位点突变3株，上述突变均表现为高浓度耐药，其MIC均不低于4μg/ml。在gyrA和gyrB未突变菌株中，通过real-timePCR检测发现在高浓度耐药的2株菌株中，Rv0933和Rv2938的转录水平显著高于其他低浓度耐药菌株，较对照株H37Rv转录水平高16倍和5倍。在对照组和转入pEASY-E1-Rv2938的大肠埃希菌中MIC均小于0．125μg／ml，而转入pEASY-E1-Rv0933的大肠埃希菌的MIC为2μg／ml。结论本研究结果显示，gyrA耐药决定区基因突变与氧氟沙星高浓度耐药相关，PstB可能是氧氟沙星特异性的药物外排泵基因，其高水平表达与氧氟沙星高浓度耐药相关。

结核分支杆菌耐喹诺酮分子机制的研究

目的了解结核分支杆菌耐喹诺酮药物的分子机制,建立快速的药敏的方法。方法通过16SrRNA聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析77株分支杆菌临床分离株;通过PCR-SSCP和直接测序技术(PCR-DS)分析结核分支杆菌的gyrA基因突变的情况。结果75株为结核分支杆菌复合群。以结核分支杆菌标准菌株H37Rv和卡介苗为对照,30株喹诺酮敏感株的gyrA基因的SSCP图谱均泳动正常,测序分析与对照株相同。45株耐喹诺酮的菌株中,34株(75.6%)gyrA基因SSCP图谱泳动异常;测序证实10株为90位密码子的突变,24株为94位密码子突变,所有gyrA突变株的氧氟沙星4μg/ml≤MICs≤32μg/ml,左氧氟沙星2μg/ml≤MICs≤16μg/ml。结论gyrA基因突变,尤其90位和94位密码子突变是结核分支杆菌耐喹诺酮的主要分子机制,PCR-SSCP可能成为测定部分结核分支杆菌喹诺酮耐药基因型的简便、快速的方法,并有望直接用于临床标本喹诺酮敏感性试验。

鸭源大肠杆菌对氟喹诺酮类耐药机制的研究

目的:分析鸭源大肠杆菌对喹诺酮类药物耐药机制。方法:微量肉汤稀释法测定4种喹诺酮类药物对22株鸭源大肠杆菌分离菌及恩诺沙星诱导耐药菌的抗菌活性,并通过PCR和DNA测序检测DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ基因(gyrA、gyrB、parC、parE)突变情况。结果:22株分离菌及诱导菌均扩增出目的片段,有18株菌对喹诺酮类药物耐药,耐药率约为82%。基因测序及分析表明:在9个测序菌株中,分别有5、2、6和7株出现gyrA、gyrB、parC和parE碱基突变;其中,gyrA基因突变,gyrB与parC或parE基因同时突变与耐药表型一致,3株仅有parC或parE基因突变的菌株并不明显耐药。gyrA基因突变均为双突变(Ser104→Leu和Asp108→Asn)。结论:鸭大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药严重,其主要机制是喹诺酮类耐药决定区(QRDR)的基因突变,特别是多个位点同时突变导致高水平耐药。

福氏志贺菌喹诺酮类耐药临床分离株gyrA和parC的基因突变

目的检测福氏志贺菌喹诺酮类耐药临床分离株DNA旋转酶gyrA和拓扑异构酶ⅣparC基因的突变情况,探讨GyrA和ParC氨基酸改变与喹诺酮类耐药的相关性。方法根据药敏实验结果选取47株福氏志贺菌临床分离菌,对其gyrA、parC喹诺酮耐药决定区(QRDR)进行聚合酶链反应(PCR)扩增和测序分析,并采用SAS(V8.2)软件分析GyrA和ParC改变和喹诺酮类耐药性的关联程度。结果44株喹诺酮类耐药菌在gyrA、parC基因QRDR均发生有义突变,gyrA83位密码子突变(TCG→TTG)最为常见,存在于43株耐药菌。混合模型分析结果显示GyrA83位、ParC80位氨基酸改变与萘啶酸的耐药性密切相关(P<0.01,R2=0.999),GyrA83、87位氨基酸改变与环丙沙星的耐药性密切相关(P<0.05,R2=0.872)。结论GyrASer83→Leu突变是导致福氏志贺菌临床株对喹诺酮类耐药的关键突变,此单位点突变即可介导福氏志贺菌对萘啶酸的耐药,但对环丙沙星耐药需同时存在GyrA和/或ParC多个位点突变或其他耐药机制。

氟喹诺酮类抗菌药物的药动学/药效学研究进展

氟喹诺酮类是在喹诺酮结构的基础上,6位引入氟原子、7位引入哌嗪环或其他衍生物后形成的新一代喹诺酮类药。该类药自出现以来,发展非常迅速,目前已发展到第四代。氟喹诺酮类抗菌药物抗菌谱广、抗菌活性强,通过与细菌DNA促旋酶、拓扑酶发生交互作用,影响DNA的合成而起到杀菌作用,对多种病原微生物和耐药菌株均具有良好的杀灭效果,在临床方面应用广泛。