喉癌组织中DNA修复基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶启动子区过甲基化研究

目的 O6 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶 (O6 methylguanineDNAmethyltransferase ,MGMT)在烷化剂所致DNA损伤的修复中起重要作用 ,启动子区过甲基化而导致MGMT基因的转录失活。本文探索了喉癌中MGMT基因启动子区过甲基化状态及其mRNA表达情况。方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应及半定量逆转录聚合酶链反应 (reversetranscriptionpolymerasechainreaction ,RT PCR)法分析喉癌、癌旁和正常喉部组织中MGMT基因启动子区过甲基化状态及其mRNA表达情况。结果 4 6例喉癌组织中有 16例 (34 8% )MGMT基因启动子过甲基化 ,相应的癌旁及正常组织中均无甲基化。MGMT基因甲基化在不同的病理分级 (χ2 =3 130 ,P =0 0 77)和临床TNM分期 (χ2 =3 95 7,P =0 138)中差异无显著性。所有甲基化的癌组织中均无MGMTmRNA表达 ,而所有非甲基化的癌组织、相应癌旁组织和 5例正常组织中均有MGMTmRNA表达。且非甲基化的癌组织中MGMTmRNA表达较癌旁组织 (t=30 5 4 0 ,P <0 0 1)和正常组织 (t=31 882 ,P <0 0 1)强 ,而癌旁和正常组织之间差异无显著性(t=0 4 19,P =0 6 77)。

O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与肿瘤

DNA修复酶O6 -甲基鸟嘌呤 -DNA甲基转移酶 (MGMT)是机体修复烷基加合物的关键酶。该酶结构与功能异常与肿瘤发生、发现、有效治疗及肿瘤耐药性等方面都有着密切的联系 ,本文综述了近年来的研究进展。

O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在顺铂激活的胃癌细胞自噬中的作用

目的探讨DNA修复酶O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)在顺铂(cisplatin)激活的胃癌SGC-7901细胞自噬中的作用。方法 Western blot法检测自噬底物蛋白p62水平、自噬标志分子Ⅱ型和Ⅰ型微管相关蛋白轻链3(mircotuble-associated protein light chain 3,LC3)的比值变化、MGMT蛋白水平;GFP-LC3表达质粒转染胃癌SGC-7901细胞后用激光共聚焦显微镜观察顺铂对细胞自噬小体形成的影响。qRT-PCR法检测MGMT基因mRNA表达水平。结果顺铂剂量依赖性激活胃癌SGC-7901细胞自噬水平,显著增加SGC-7901细胞中自噬小体数量;MGMT mRNA及蛋白水平随顺铂浓度的增加而降低(P<0.05);过表达MGMT抑制胃癌SGC-7901细胞的基础自噬水平;过表达MGMT抑制顺铂激活的胃癌SGC-7901细胞自噬。结论 DNA修复酶O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抑制顺铂激活的胃癌SGC-7901细胞自噬。

DNA修复相关基因启动子甲基化和肿瘤化疗耐药的进展

肿瘤细胞DNA修复能力与化疗药物敏感性密切相关,而DNA启动子甲基化可导致DNA修复相关基因转录失活、基因沉默、蛋白表达量改变等影响DNA的修复能力,继而导致肿瘤对化疗药物的固有性或获得性耐药。该文着重阐述DNA修复相关基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、人类mut1同源物(hMLH1)和范科尼贫血互补基团F(FANCF)启动子甲基化与肿瘤化疗耐药之间的关系。

DNA修复基因O^6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在人群肺癌发生中的作用

目的 探讨DNA修复基因O6 甲基鸟嘌呤 DNA甲基转移酶 (O6 methylguanine DNAmethyltransferase ,hMGMT)在人群肺癌发生中的作用。方法 用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测 15 0例肺癌组织、40例正常肺组织、5 0对肺癌病例和对照外周血单个核细胞中hMGMT基因mRNA的表达 ;用免疫组化检测p5 3、C MYC、K RAS基因表达 ;并分析有关暴露因素对修复基因hMGMT表达的影响 ,以及hMGMT基因与 p5 3、C MYC、K RAS等癌变相关基因的关系。 结果3 2 .7% ( 49 15 0 )的肺癌组织和 5 .0 % ( 2 40 )的正常肺组织存在hMGMT基因表达低下 ,hMGMT基因表达低下与肺癌发生的危险度OR值为 9.2 2 ( 2 .0 5～ 5 7.65 )。 2 0 .0 % ( 10 5 0 )的肺癌病人外周血和4% ( 2 5 0 )的正常人外周单个核细胞血细胞也可检出hMGMT基因表达低下。探讨影响hMGMT基因表达的各种暴露因素 ,发现吸烟可抑制hMGMT基因表达。另外发现 ,K RAS癌基因的过度表达与hMGMT表达低下有关 (P <0 .0 5 ) ;而 p5 3、C MYC基因的表达与hMGMT无关。结论 DNA修复基因hMGMT可能在肺癌发生中起着重要的作用 ,其表达低下是人群发生肺癌的危险因素之一 。

血浆中抑癌基因MGMT、P16、CDH13和RASSF1A甲基化在肺癌诊断中的作用

目的:探讨血浆中抑癌基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)、P16、T-钙黏蛋白13(CDH13)和信号传导通路基因(RASSF1A)甲基化在肺癌诊断中的作用。方法:选取2016年2月至2018年4月收治的100例肺癌患者、100例肺部良性病变患者和100例正常人血液标本,采用甲基化特异性PCR法检测患者血液中MGMT、P16、CDH13和RASSF1A基因启动子区域甲基化发生情况。结果:肺癌患者血液标本中MGMT、P16、CDH13和RASSF1A基因启动子区甲基化发生率分别为36.00%、55.00%、35.00%和27.00%。患者血液标本基因MGMT、P16、CDH13和RASSF1A基因启动子区甲基化率的多项指标联合检测明显优于各指标的单独检出,差异具有统计学意义(P<0.05)。患者血液标本基因MGMT(χ^2=6.261,P=0.012)、P16(χ^2=4.355,P=0.037)、CDH13(χ^2=4.408,P=0.036)和RASSF1A(χ^2=4.269,P=0.039)基因启动子区甲基化率与患者吸烟指数明显相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。患者血液标本基因MGMT、P16、CDH13和RASSF1A基因启动子区甲基化率与患者组织标本中MGMT、P16、CDH13和RASSF1A基因启动子区甲基化率保持一致性,差异无统计学意义(P<0.05)。结论:肺癌患者血液中MGMT、P16、CDH13和RASSF1A基因甲基化的联合检测可以成为临床筛查和诊断肺癌的有效方法。

MGMT基因甲基化水平与恶性胶质瘤细胞对烷化剂耐药性的相关性

目的探讨DNA修复蛋白6-O-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因甲基化状态与恶性胶质瘤细胞对烷化剂抗肿瘤药物耐药性的相关性。方法选择36例经手术后病理学检查确诊的恶性胶质瘤患者作为研究组,选取同期脑卒中患者10例作为对照组,比较两组患者术前、术后脑组织中的MGMT蛋白表达水平、MGMT甲基化状态差异,并分析MGMT甲基化与治疗效果的关系。结果研究组的MGMT蛋白表达阳性率显著高于对照组,去甲基化水平显著高于对照组(P<0.05)。有效组16例患者,无效组20例患者,有效组MGMT蛋白表达阳性率显著低于无效组,甲基化水平显著高于无效组(P<0.05)。Ⅲ级患者17例,Ⅳ级19例,两种不同病理分级患者的MGMT蛋白、MGMT启动子基因表达率上无差异(P>0.05)。MGMT蛋白表达阳性的20例患者中仅有3例甲基化表达(15%),MGMT蛋白表达阴性的16例患者中有14例甲基化表达(87.5%),MGMT蛋白表达与MGMT启动子基因甲基化状态具有关联性(χ2=18.747,P=0.000)。结论 MGMT蛋白表达与MGMT启动子基因甲基化状态呈负相关性,MGMT基因去甲基化状态会增加恶性胶质瘤细胞的耐药性。

基于成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因启动子区甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺耐药性影响

目的探讨成簇的规律性间隔的短回文重复序列关联的失活核酸酶9-脱氧核糖核酸甲基转移酶3A基因复合体(CRISPR-dcas9-DNMT3A)介导的O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因(MGMT)基因启动子区域DNA甲基化修饰对胶质瘤细胞替莫唑胺(TMZ)耐药性的影响。方法 CRISPR-dcas9-DNMT3A表达载体通过慢病毒包装感染TMZ耐药细胞系U251-R[U251(中国医学科院基础医学研究所)通过替莫唑胺高浓度反复间歇诱导法诱导产生], 验证其对MGMT启动子区域DNA甲基化程度, MGMT表达水平以及TMZ药物敏感性影响。结果慢病毒感染成功的U251-R细胞, MGMT启动子区域甲基化水平增高[44.7%(17/38)、63.2%(24/38)、77.1%(27/38)比7.9%(3/38), P<0.05], MGMT蛋白表达减少, 细胞对TMZ化疗的敏感性增加(P<0.05)。结论 CRISPR-dcas9-DNMT3A慢病毒感染的U251-R细胞可通过增加其MGMT基因启动子区域甲基化水平减少MGMT蛋白表达从而增加化疗敏感性。

MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态对脑胶质瘤预后的影响

目的探讨脑胶质瘤DNA修复基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)和错配修复基因(MMR)(hMLH1、hMSH2)启动子甲基化状态及其对患者预后和烷化剂化疗敏感性的影响。方法采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测39例脑胶质瘤和6例正常脑组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态,免疫组化方法测定其蛋白表达。绘制Kaplan-merier生存曲线。结果脑胶质瘤组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46.2%、10.3%和20.5%,而正常脑组织相应基因启动子区未发生甲基化;三种基因启动子未甲基化模式与其对应蛋白表达模式相似。MGMT基因甲基化的脑胶质瘤患者存活率显著高于未甲基化者(P<0.05);MMR基因甲基化患者中MGMT基因甲基化与未甲基化者的生存期无统计学差异(P>0.05)。结论hMLH1、hMSH2及MGMT甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件;联合检测MGMT、hMLH1和hM-SH2基因启动子甲基化状态可判断脑胶质瘤患者的预后及其对烷化剂化疗的敏感性。

脑胶质瘤MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态研究

目的:探讨脑胶质瘤患者O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因MGMT和错配修复基因hMLH1、hMSH2启动子CpG岛甲基化状态,及其在烷化剂化疗中的意义。方法:采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测39例脑胶质瘤和6例正常脑组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区的甲基化状态,免疫组化方法测定蛋白表达。结果:脑胶质瘤患者组织MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子区甲基化发生率分别为46.2%、10.3%和20.5%,3种基因启动子未甲基化模式与其对应蛋白表达模式相似,并与患者性别、年龄、病理类型和病理分级无明显相关性。回顾性分析患者资料,显示39例脑胶质瘤患者中,MGMT基因甲基化的患者生存期显著高于MGMT基因未甲基化患者(P<0.05,Log-rank检验)。结论:MGMT及错配修复基因甲基化是脑胶质瘤发生过程中常见的分子事件,可能与肿瘤的发生有关;检测MGMT、hMLH1和hMSH2基因启动子甲基化状态,在判断脑胶质瘤患者预后和预测烷化剂化疗耐药性中可能具有重要意义。

DVC1在氮芥致人支气管上皮细胞DNA-蛋白交联损伤修复中的作用

目的探讨蛋白水解酶DVC1在氮芥诱导人支气管上皮细胞DNA-蛋白交联损伤修复中的作用。方法利用siRNA干预DVC1表达,50μmol/L氮芥染毒细胞后,采用Western blot检测DNA损伤修复蛋白的表达;荧光酶标仪测定1~24 h DNA-蛋白交联总量;Slot blot检测DNA与O 6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O^(6)-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)的共价交联;免疫沉淀检测MGMT泛素化水平。构建GST-DVC1融合蛋白,GST下拉实验检测DVC1与MGMT、泛素的结合。结果si-DVC1干预后,DNA-蛋白交联总量升高。氮芥降低交联蛋白MGMT原型的水平,但增强其泛素化水平;DVC1可结合泛素,si-DVC1可进一步增强MGMT的泛素化及DNA-MGMT的交联量,与泛素结合酶抑制剂NSC697923和蛋白酶体抑制剂MG132引起的交联结果类似。si-DVC1引起DNA损伤修复蛋白Rad51表达降低、Ku70表达升高。结论DNA-蛋白交联的清除依赖于交联蛋白的泛素化;DVC1通过与泛素相互作用,促进氮芥诱导的DNA-蛋白交联的清除,并维持DNA以同源重组方式修复损伤的能力。

O6-MG-DNA-甲基转移酶基因表达调控及其与肿瘤耐药性的研究进展

DNA损伤修复在基因突变、肿瘤发生及细胞死亡等过程中起重要作用，烷化类损伤主要由O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）修复。细胞内MGMT活性高低是肿瘤对替莫唑胺（temozolomide，TMZ）等烷化剂类化疗药产生耐药性的原因之一，其启动子甲基化与肿瘤患病风险及预后相关。研究MGMT基因表达调控对DNA损伤修复理论研究及克服肿瘤耐药均有重要意义。MGMT的表达调控机制主要包括启动子甲基化及组蛋白乙酰化、转录水平调控、转录后水平调控。

亚砷酸钠对HaCaT细胞MGMT基因启动子区甲基化CpG结合蛋白-2、DNA甲基转移酶1、组蛋白去乙酰化酶-1结合的影响

目的观察亚砷酸钠（NaAsO：）对人肤角质形成细胞株（HaCaT细胞）MGMT基因启动子区甲基化CpG结合蛋白-2（MeCP2）、DNA甲基转移酶1（DNMTl）及组蛋白去乙酰化酶1（HDACl）结合情况的影响，为深化阐释砷毒作用机制提供依据。方法分别以0．00（空白对照）、3．13、6，25、12．50、25．00μmol／LNaAs02重复间隔处理HaCaT细胞72h（NaAs02处理24h，隔天再次相同处理，重复3次），以人表皮鳞癌细胞株（A431）作为阳性对照。定量染色质免疫共沉淀技术（Q—CHIP）检测MGMT基因转录调控区CHIPl、CHIP2区域及MGMT基因编码区ChIP3区域MeCP2、DNMTl、HDACl结合情况。结果各组HaCaT细胞MGMT基因转录调控区CHIPl、CHIP2区域MeCP2、DNMTl、HDACl蛋白结合水平比较，差异有统计学意义（F值分别为7．387、84．634、78．442和19．263、69．649、26．546，P均〈0．05）；其中各N以s02处理组CHIPl、CHIP2区域MeCI〉2、DNMTl、HDACl蛋白结合水平[3．13μmol／LNaAs02处理组：（136．00±16．97）％、（145．00±2．83）％、（88．50±19．09）％和（106．50±37．48）％、（112．34±8．73）％、（59．71±8．49）％；6．25μmol／LNaAs02处理组：（130．00±42．43）％、（154．50士4．95）％、（101．00±1．27）％和（88．50±3．54）％、（134．32±2．82）％、（102．75±19．91）％；12．50~mol／LNaAs02处理组：（141．50±23．33）％、（161．50±7．78）％、（125．00±U．31）％和（119．50±24．75）％、（171．59±3．54）％、（167．61±10．61）％；25，00μmol／LNaAs02处理组：（134．50±43．13）％、（472．50±50．20）％、（383．50±30．41）％和（180．09±12．73）％、（348．50±27．58）％、（158．45±12．02）％]均高于空白对照组[（51．50±9．19）％、（82．00±12．73）％、（25．03±2．91）％和（37．02±4．24）％、（91．56±26．16）％、（19．09±2．90）％，P均〈0．05]。各组HaCaT细胞MGMT基因编码区CHIP3区域MeCP2蛋白结合水平比较，差异无统计学意义（F=1．670，P〉0．05），而DNMTl、HDACl蛋白结合水平比较，差异有统计学意义（F值分别为4．404、9．863，P均〈0．05），其中25．00I,Lmol／LNaAs02处理组DNMTl、HDACl蛋白结合水平[（615．85±29．63）％、（306．09±59．40）％]与空白对照组[（99．70±12．02）％、（92．45，±48．79）％]比较，差异有统计学意义（P均〈0．05）。结论MeCP2可结合于砷所致高甲基化MGMT基因转录调控区。通过招募DNMTl及HDACl使组蛋白去乙酰化，同时DNMTl可结合于MGMT基因编码区，以非甲基化DNA结合蛋白（IVIBD）依赖的方式招募HDACl，通过染色质重塑方式导致MGMT基因沉默，可能是砷毒性表现的早期分子事件。

DNA-PKcs蛋白和MGMT蛋白在肝癌组织中的表达及意义

目的探讨DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs)和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在肝癌发生、发展中的作用及临床应用价值。方法应用免疫组化方法检测DNA-PKcs蛋白和MGMT蛋白在68份肝癌组织(肝癌组)和10份正常肝脏组织(对照组)中的表达情况,采用χ2检验及Spearman秩和相关检验分析结果。结果肝癌组及对照组DNA-PKcs蛋白表达阳性率分别为85%和10%,MGMT蛋白表达阳性率分别为40%和90%(P均<0.05);两者表达具有负相关性(r=-0.475,P<0.05)。结论DNA-PKcs和MGMT在肝癌发生、发展中起重要作用:有望作为肿瘤标记物、基因靶点等用于肝癌的诊治。

亚砷酸钠对HaCaT细胞MGMT基因甲基化和mRNA及蛋白表达水平的影响

目的 了解不同剂量亚砷酸钠（NaAsO2）处理的人皮肤角质形成细胞（HaCaT细胞）中MGMT基因甲基化特征,以及MGMT基因甲基化对其转录和表达的调控.方法 以3.13、6.25、12.50、25.00 μmol/L NaAsO2重复间隔处理HaCaT细胞72 h.硫化测序PCR（BSP）检测MGMT基因转录起始点-329～＋93甲基化热点区域,实时荧光定量PCR（Q-PCR）及免疫印迹分析（Westem blotting）检测MGMT基因的mRNA及蛋白表达.设不染毒的HaCaT细胞为空白对照,人表皮鳞癌细胞株A431为阳性对照.结果 3.13、6.25、12.50、25.00μmol/L NaAsO2处理组,MGMT基因启动子区DNA甲基化水平分别为0.63%（1/160）、6.25%（10/160）、10.63%（17/160）和18.75%（30/160）.且甲基化的CpG位点主要位于转录起始点-249～-146区域,空白对照组未检出甲基化,组间比较差异有统计学意义（x2=76.687,P〈0.05）;3.13、6.25、12.50、25.00 μmol/L NaAsO2处理组MGMT mRNA相对表达量分别为1.518 31±0.180 54、1.425 22±0.180 39、1.014 54 ±0.096 79、0.887 72 ±0.020 00,与空白对照组（1.198 29±0.159 97）比较,差异有统计学意义（F=37.359,P〈0.05）;3.13、6.25、12.50、25.00 μmol/L NaAsO2处理组MGMT蛋白相对表达量分别为1.174 47±0.064 75、0.848 83 ±0.057 01、0.471 63±0.023 34、0.240 34±0.014 43,与空白对照组（1.066 19±0.061 24）比较,差异有统计学意义（F=20.687,P〈0.05）.结论 砷通过导致MGMT基因启动子区CpG岛高甲基化.抑制MGMT基因mRNA转录及蛋白表达,是砷致皮肤损害的重要机制之一.

PTEN、MGMT和DNA-PKcs在男性乳房发育症乳腺中的表达及其生物学意义

目的观察PTEN、MGMT和DNA-PKcs在男性乳房发育症(GM)乳腺中的表达及其意义。方法采用免疫组化SP法检测68例GM乳腺(实验组)与24例正常男性乳腺(对照组)中PTEN、MGMT和DNA-PKcs的表达状况,并将实验组按组织学类型(硬化型、过渡型、旺炽型)分为3组分别研究。结果 PTEN、MGMT和DNA-PKcs在GM乳腺与正常男性乳腺中均有表达。GM乳腺中的3项表达水平较正常男性乳腺显著降低(P<0.01),硬化型、过渡型、旺炽型中3项表达水平也依次降低。PTEN、MGMT和DNA-PKcs的表达两两之间比较无显著相关性(P>0.05)。结论 GM乳腺组织中PTEN、MGMT和DNA-PKcs表达的异常可能与GM的发生有关。

慢性氟中毒大鼠血细胞MGMT与hMLH1基因mRNA的表达

目的:研究慢性氟中毒大鼠血细胞中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因(MGMT)及错配修复基因(h MLH1)mRNA表达水平。方法:采用饮水加氟法复制20只慢性氟中毒大鼠模型为染氟毒组,另取20只大鼠饮用含氟量<0.5 mg/L自来水为对照组,两组大鼠饲养6月时,观察大鼠氟斑牙的形成,鉴定染氟是否成功,同时采取股动脉放血处死大鼠,提取大鼠血细胞总RNA,实时荧光定量PCR法检测染氟毒组及对照组大鼠MGMT、h MLH1基因mRNA水平。结果:染氟组20只大鼠全出现氟斑牙,表明染氟成功;氟中毒大鼠血液MGMT、h MLH1基因mRNA表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:MGMT和h MLH1 mRNA水平降低可能是氟中毒引起DNA损伤的机制之一。