利用DNA免疫技术制备SAX蛋白多克隆抗体

骨形态发生蛋白(BMP)属于细胞因子和转化生长因子β(TGF-β)超家族,在胚胎形态发生和器官形成中起重要作用,但目前缺乏BMP信号通路I型受体SAX的各类抗体。本文利用果蝇胚胎提取出总RNA,反转录得到cDNA,将其作为模板通过PCR得到sax基因片段,将片段连接到pCAGGS-P7上,构建成重组质粒pCAGGS-P7-sax。采用质粒DNA免疫技术,免疫了BALB/C小鼠,制备了果蝇SAX蛋白多克隆抗体。进一步分析表明,构建的真核表达重组质粒pCAGGS-P7-saxDNA具有良好的免疫原性,在免疫小鼠后所获得的抗血清抗体效价达1∶100。Western blot和果蝇胚胎免疫荧光检测表明,抗血清能特异型地识别SAX蛋白。果蝇SAX抗体的成功制备为进一步研究sax基因及BMP信号在果蝇心脏发育中的作用奠定了基础。

利用DNA免疫技术制备GATA1蛋白多克隆抗体

转录因子GATA1对正常红系细胞的分化起着关键作用,其缺失导致原成红细胞的凋亡,其过表达则能抑制红系细胞晚期的分化。本研究为了进一步利用斑马鱼研究gata1基因在血液血管发育过程中的功能,通过反转录PCR(RT-PCR)扩增了斑马鱼gata1基因编码区序列,构建了真核表达质粒pCAGGS-P7/gata1,采用质粒DNA免疫技术的方法免疫了BALB/c小鼠,制备了斑马鱼GATA1蛋白多克隆抗体。实验结果表明:构建的真核表达重组质粒pCAGGS-P7/gata1 DNA具有良好的免疫原性,在免疫小鼠后所获得的抗血清抗体效价达1∶500。Western blot和免疫荧光检测表明,抗血清能特异型地识别GATA1蛋白。斑马鱼GATA1抗体成功制备为进一步的功能研究奠定了重要基础。

利用DNA免疫技术制备ASB11蛋白的多克隆抗体

ASB11参与胚胎神经祖细胞的发育、再生性肌发生以及泛素化等过程,但其机制仍不清楚。为了进一步研究斑马鱼Asb11基因的作用机制,本研究采用DNA免疫技术制备了ASB11多克隆抗体;利用斑马鱼Asb11的c DNA构建p CAGGS-P7/ASB11重组表达质粒,肌肉注射入6-8周龄的BALB/c小鼠体内,诱导抗原蛋白的表达和免疫应答的发生。结果显示,制备的p CAGGS-P7/ASB11重组质粒具有较好的免疫原性;将提取的抗血清进行Western-blot和免疫荧光检测,显示所制备的多克隆抗体抗体效价为1∶400,抗血清抗体能特异的结合ASB11蛋白。本研究为后续的功能研究奠定了基础。

利用DNA免疫技术制备WNT16蛋白多克隆抗体

Wnt16属于非经典wnt信号途径上的一员,目前有大量的研究表明wnt16与胚胎的血液发育和骨骼发育相关。为了阐明wnt16在造血过程中的调控机制,利用RT-PCR(逆转录PCR)扩增斑马鱼wnt16基因的ORF(开放阅读框)序列全长,构建真核表达载体pCAGGS-P7/wnt16,测序正确后,用该表达载体免疫BALB/c雌鼠,进行DNA免疫,制备斑马鱼抗WNT16特异性多克隆抗体。结果表明:通过DNA免疫制备的斑马鱼抗WNT16抗血清能特异性识别WNT16蛋白。斑马鱼WNT16抗体成功制备为进一步的功能研究奠定了重要基础。