木犀草素对人胃癌细胞DNA双链断裂及同源重组修复的影响

目的探讨木犀草素对人胃癌细胞DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)及同源重组(homologous recombination,HR)修复的影响。方法采用流式细胞仪检测作用木犀草素后各组细胞内ROS水平变化及GFP阳性率;彗星实验检测木犀草素对DSBs的影响;Western blotting检测DNA损伤标志性蛋白γH2AX和HR修复蛋白Rad51的表达;免疫荧光检测DNA损伤修复相关蛋白表达的募集情况。结果木犀草素以剂量依赖性方式增加胃癌细胞内ROS含量;用I-Scel质粒转染DR-GFP后木犀草素处理组GFP阳性细胞比例明显少于未加木犀草素组;但彗星实验表明,木犀草素处理后人胃癌AGS细胞后增加彗星尾炬;经木犀草素处理后,胃癌细胞中DNA的γH2AX上调,修复关键蛋白Rad51的表达下调;免疫荧光结果表明,在木犀草素处理人胃癌AGS细胞后HR修复蛋白Rad51在DNA损伤位点的募集减少。结论木犀草素能够促进人胃癌细胞DSBs,并抑制其HR修复。

DNA双链断裂修复缺陷在神经退行性疾病发生中的作用

DNA双链断裂修复(DNA Double-Strand Break Repair,DSBR)在保持神经元基因组稳定性和细胞存活方面发挥着重要作用。DSBR主要通过同源重组(Homologous Recombination,HR)及非同源末端连接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)来完成,这两种修复途径对于维持神经元的正常生理功能至关重要。另外,DSBR异常在多种神经退行性疾病中扮演重要角色,因此,深入剖析DSBR机制对于理解神经退行性疾病的病理发生及研发有效治疗手段具有重要意义。本文综述了常见的DSBR途径,并概述了DSBR异常与几种常见神经退行性疾病发病机制的最新研究进展。

γ射线诱导的肝癌细胞DNA双链断裂

为了揭示辐射生物学效应的机理，用倒转脉冲场凝胶电泳（ＰＩＧＥ）研究了γ射线辐照肝癌ＳＭＭＣ—７７２１细胞诱导的ＤＮＡ双链断裂（ＤＳＢ）及其修复２４、４８ｈ后的产额和片段的分布情况。结果表明：修复０ｈ和２４ｈ的样品，ＤＮＡ片段释放百分比（ＰＲ）随着剂量的增加而增加；诱导的ＤＳＢ片段主要是 １Ｍｂｐ— ２Ｍｂｐ的大片段； ＤＳＢ产额分别为 ０．３８ＤＳＢｓ／１００Ｍｂｐ· Ｇｙ和０．０６ＤＳＢｓ／１００Ｍｂｐ·Ｇｙ，即２４ｈ内，约８４％的ＤＳＢ发生了重接；修复４８ｈ后残余的ＤＳＢ片段与剂量无关，且与对照细胞的ＤＳＢ片段含量相近。可见，γ射线诱导的ＤＳＢ容易发生修复；未修复的ＤＳＢ将导致细胞的增殖死亡。

碳离子诱导的DNA双链断裂

ＤＮＡ双链断裂（ＤＳＢｓ）是电离辐射诱导的最重要的原发损伤，研究ＤＳＢｓ有利于揭示细胞辐射敏感性的机理。用倒转脉冲场凝胶电泳结合荧光扫描进行ＤＮＡ定量研究７５ＭｅＶ／ｕ１２Ｃ６＋对小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞ＤＳＢｓ的诱导，结果表明：ＤＳＢｓ产额约为０．７４ＤＳＢｓ／１００Ｍｂｐ／Ｇｙ；ＤＮＡ片段分布在两个区域。大片段区分子量约为１．４Ｍｂｐ～３．２Ｍｂｐ，分子量小于１．２Ｍｂｐ的为小片段区；并且随着剂量的增加，大片段区ＤＮＡ含量逐渐下降，而小片段区的ＤＮＡ含量显著增加。表明Ｂ１６ＤＮＡ分子上可能存在对重离子较为敏感的位点。

高LET重离子照射人肿瘤细胞的DNA双链断裂及修复研究

依托兰州近代物理研究所的HIRFL装置对人肝癌细胞SMMC-7721进行高LET的重离子辐照,同时利用脉冲场凝胶电泳研究高LET辐射引起的细胞DSB及其修复的特点。对于不同离子的辐射进行了比较分析,探索重离子的辐射生物学效应机理。结果发现,随着剂量的增加,初始DSB在给定剂量范围内呈线性增长,LET较高的氩离子的剂量效应曲线具有较大的斜率。对于DSB分布情况的研究发现,LET不同,大小片段的分布随着剂量的变化呈现不同的变化情况。修复研究显示两种LET辐射的快修复在30min左右都已经结束,此后都开始了慢修复,对于高LET的氩离子辐射来说,快修复和慢修复完成的修复量均高于较低LET的碳离子辐射。4h时,两种辐射残余的DSB基本一致。结果证明了高LET辐射下初始DSB与剂量的线性依赖关系,且发现不同种类的离子辐射引起的DSB的剂量效应曲线的斜率不同。结果也显示了DSB的非随机分布现象和DSB修复的双阶段模式,发现LET、离子种类和剂量对于DSB的片段非随机分布同时存在影响,同时修复结果提示慢修复机制和错修复在高LET辐射引起损伤的修复研究中可能具有重要意义。

重离子辐照诱导DNA双链断裂的剂量率效应

利用不同剂量率的 5 0MeV/u12C6+ 辐照B16黑色素瘤细胞的脱蛋白DNA ,采用脉冲场凝胶电泳技术对DNA双链断裂 (DSB)的诱导和片段的分布进行了研究。结果发现 ,在剂量率分别为3Gy/min和 30Gy/min的情况下 ,DNA片段释放百分比 (PR)都随着剂量的增加而增加 ,并在超过一定剂量之后趋于相似的准阈值 ;3Gy/min辐照诱导DSB的产额为 0 .4 0DSBs/ (10 0Mbp .Gy) ,30Gy/min辐照诱导的DSB产额准确值无法得到 ;30Gy/min辐照诱导DSB的截面为 2 .14μm2 ,是 3Gy/min的 3.1倍。所有结果都表明剂量率越高 ,诱导DSB越有效。另外 ,3Gy/min辐照诱导DSB片段在 -86 0kbp处有一个片段峰 ,而 30Gy/min没有 ,说明剂量率可以影响DSB片段的分布。

电离辐射诱导的DNA双链断裂

利用γ射线和不同LET的碳离子辐照小鼠B16黑色素瘤细胞、Hela细胞、V79中国仓鼠肺细胞和人肝癌SMMC -7721细胞的DNA ,采用脉冲场凝胶电泳结合荧光扫描技术研究了DNA双链断裂(DSB)片段的分布。结果发现DSB片段是非随机分布的 ,而且这种分布与DNA序列有关。原因可能在于沉积的能量直接或间接沿DNA链迁移 ,链上相对较弱的化学键优先产生反应 ,并最终导致链的断裂 ,从而引起断裂的不均匀分布。

DNA双链断裂损伤修复系统研究进展

多种内源或外源因素都能造成细胞基因组DNA损伤,细胞内建立了复杂的修复系统来应对不同形式的损伤。其中DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)作为最严重的损伤形式,主要激活同源重组修复(Homologous recombination repair)和非同源末端连接(Non-homologous end joining)通路。这两条通路都是由多个修复元件参与、经过多步反应的复杂过程。两者各具特点、协同作用,共同维护细胞基因组的稳定性。对其分子机制的阐明为肿瘤放化疗的辅助治疗提供了潜在的作用靶点。

重离子诱导的质粒DNA双链断裂分布研究

利用能量为7.2MeV/u氖离子束辐照体外质粒DNA:pUC18,采用恒场凝胶电泳结合多功能荧光成像系统研究了pUC18双链断裂片段的分布。证实了双链断裂片段分布的非随机性,结果还发现DNA断裂后片段的交联现象,而且交联片段的分布也是非随机的。

X射线辐照诱导人神经胶质瘤细胞DNA双链损伤研究

采用免疫荧光染色法检测X射线诱导M059K细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)和磷酸化的毛细血管扩张性共济失调症突变基因(pATM)焦点的形成;流式细胞仪分析M059K细胞γH2AX和pATM表达的周期依赖性。免疫荧光染色检测结果显示,γH2AX和pATM焦点阳性细胞分别以照射后0.5、4 h表达最高,照射后24h,高剂量组焦点阳性细胞达100%。流式细胞仪分析结果显示,γH2AX和pATM的表达具有细胞周期依赖性。照射后0.5、4 h,γH2AX和pATM在细胞各期的表达均明显增加,并以G0/G1期为著;照射后24 h,γH2AX和pATM在G0/G1和S期表达降低,而G2/M期细胞表达明显增加。细胞呈现明显的G2/M期阻滞。结果提示,γH2AX和ATM信号通路参与X射线诱导的M059K细胞DNA双链断裂。

DNA双链断裂的组成与自由基清除效能的关系

Measured by gel electrophoresis scanning,it was shown that the double strand breaks (DSBs) of pBR322 irradiated by γ rays were constituted by two parts,αDSB and βDSB,and the relationship between α,β and scavenging capacity σwas obtained.Results showed that β/α non linearly decreased with increasing σ.Moreover,the yield of the OH free radicals reacting with DNA was analyzed.

DNA双链断裂产额的新算法

DNA双链断裂(DSB)的定量分析是高传能线密度辐射生物学效应机理研究的重要手段.从实际应用出发,推导了一个新的计算公式———平均分子量法.该法不探究DSB片段的具体分布模式,实际操作中却又包含了片段的含量和分布;而且形式简单、操作简便,尤其适合于荧光扫描数据.

DNA和细胞对重离子辐照诱导DNA双链断裂的敏感性比较

用倒转脉冲场凝胶电泳 (PIGE)比较研究了 50 Me V/u1 2 C6 +辐照小鼠 B1 6黑色素瘤细胞及其脱蛋白 DNA分子 ,从而诱导 DNA双链断裂 (DSB)的辐射敏感性。结果表明 ,不论辐照脱蛋白 DNA还是辐照完整细胞 ,诱导的 DNA片段释放百分比 (PR)都随着剂量的增加而增加 ,在超过 4 0 Gy后 ,PR趋向一个近似相同的准阈值～ 81 %。辐照脱蛋白 DNA诱导的 DSB产额为 0 .4 0 DSBs/1 0 0 Mbp/Gy,辐照完整细胞诱导的 DSB产额约为 0 .1 9DSBs/1 0 0 Mbp/Gy。说明脱蛋白

恒场电泳检测DNA双链断裂及其应用

应用普通恒场琼脂糖凝胶电泳检测受γ射线照射后小鼠胸腺细胞ＤＮＡ双链断裂（ｄｓｂ）。在一定条件下，该法可以获得与脉冲凝胶电泳相似的结果。用此法观察了离体照射小鼠胸腺细胞ＤＮＡｄｓｂ修复作用，发现该法可以检测到ＤＮＡ“梯状”带，可做为一种研究细胞凋亡的新方法。

植物DNA双链断裂损伤修复机制研究进展

DNA双链断裂(DSBs)是细胞最严重的损伤形式之一。高等动植物中主要通过非同源末端连接(NHEJ)途径进行DNA双链断裂修复。该途径不依赖DNA同源性,由一些修复因子如:Ku蛋白异二聚体、DNA-PKcs、XRCC4和ligaseⅣ等,将断裂末端直接连接进行修复。综述了植物DNA双链断裂损伤修复的主要途径及其相关基因研究的进展,探讨了植物DNA损伤修复研究中存在的问题与发展方向。

E838对辐射所致小鼠淋巴细胞DNA双链断裂的防护作用

目的探讨E838对辐射导致小鼠淋巴细胞DNA双链断裂的防护作用。方法小鼠照射前给予E838,观察其存活率和动物平均存活时间;用中性单细胞凝胶电泳技术,检测1Gyγ射线照射后小鼠淋巴细胞DNA双链断裂,并与给予同类药物小鼠进行比较,用CASP软件分析彗星图像,SPSS12.0进行数据的统计学分析。结果 E838预防用药能够明显提高损伤动物的30天存活率,E838低、中、高剂量组存活率分别比对照组提高55%、85%、75%,平均生存天数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001),保护指数分别为1.99、2.56、2.46。E838与炔雌醇比较,中、高剂量组的动物平均生存天数明显延长,差异有统计学意义(P<0.001)。E838能明显减轻淋巴细胞DNA双链断裂损伤,E838低、中、高组,TDNA百分比(11.68、6.24、9.05)、TL(18.53、10.09、16.02)、TM(2.13、0.64、1.21)和OTM(2.52、0.99、1.59)残余损伤逐渐减少,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.001)。E838与炔雌醇、尼尔雌醇比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 E838对辐射损伤具有明显的保护作用。

一氧化氮对辐射诱导的肿瘤细胞凋亡和DNA双链断裂的双向性影响

目的观察不同浓度的一氧化氮在不同p53基因状态的肿瘤细胞中对射线导致的细胞凋亡和DNA双链断裂的双向性影响。方法 2009年6月—2010年6月于第四军医大学放射医学实验室进行实验。选用p53缺如人非小细胞肺癌H1299细胞,稳定转染野生型p53(wtp53)或突变型p53(mp53)基因,得到H1299/wtp53或H1299/mp53细胞。细胞内质粒载体的稳定表达由RT-PCR和限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)法检测。细胞先于含不同浓度硝酸异山梨酯(ISDN)的培养基中培养,然后接受X线照射。照射后细胞凋亡和γH2AX分别由Hoechst33342染色法和流式细胞术测定。Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果在H1299/wtp53和H1299/mp553细胞中,在p53基因7号外显子RT-PCR的产物中可观察到清晰的110 bp条带。p53基因7号外显子用MspI或Bsr1限制性内切酶特异性消化后,相应地在H1299/wtp53或H1299/mp53细胞中,可以观察到清晰的70 bp条带。在H1299/wtp53细胞中,低浓度的ISDN(5μmol/L)可显著降低X线辐射诱导的凋亡和DNA双链断裂,而高浓度的ISDN(500μmol/L)却显著升高X线辐射诱导的凋亡和DNA双链断裂。而且,一氧化氮对辐射导致的Caspase-3和Bax介导的凋亡有双向性的影响。但是,对于上述浓度的ISDN,并没有在H1299/mp53细胞中观察到这些现象。结论在肿瘤细胞中,不同浓度的一氧化氮可双向性影响辐射导致的Bax和Caspase-3介导的凋亡以及DNA双链断裂的变化,并且一氧化氮可通过p53基因表达调控来影响细胞的命运。

H_2O_2－Fe^（3＋）所致人淋巴细胞DNA双链断裂损伤

采用脉冲电场凝胶电泳法检测Ｈ２Ｏ２－Ｆｅ（３＋）体系产生的ＯＨ对人淋巴细胞ＤＮＡ的双链断裂损伤．Ｈ２Ｏ２－Ｆｅ（３＋）浓度与ＤＮＡ双链断裂呈明显量效关系；随ＯＨ作用时间延长，细胞ＤＮＡ双链断裂加重；过氧化氢酶对ＯＨ损伤有明显抑制作用．脉冲电场凝胶电泳法可检测到的Ｈ２Ｏ２和ＦｅＣｌ３引起细胞ＤＮＡ双链断裂的最低浓度为０．３ｍｍｏｌ／Ｌ和６μｍｏｌ／Ｌ．

α辐射致DNA双链断裂的AFM观测

利用先进的原子力显微镜(AFM)技术及凝胶电泳技术,对5.48 MeV的α粒子辐照后的水中pGEMTl质粒DNA进行分析,通过AFM观测,得到了清晰的DNA分子及α辐射致其双链断裂的直观图,并采用凝胶电泳对辐照前后DNA的损伤机理进行了研究,结果表明DNA链的断裂数目随着粒子照射剂量的增加而增加,并通过测量DNA片段所占比例关系,可获得DNA的片段分布.

DNA双链断裂损伤反应及它的医学意义

DNA损伤应激反应是维持基因组稳定性的基石.细胞在长期进化中形成了由损伤监视、周期调控、损伤修复、凋亡诱导等在内的自稳平衡机制.一方面,借助感应、识别并启动精细而复杂的修复机制修复损伤;另一方面,通过DNA损伤应激活化的细胞周期检查点机制,延迟或阻断细胞周期进程,为损伤修复提供时间,使细胞能安全进入新一轮细胞周期;损伤无法修复时则诱导细胞凋亡.DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)是真核基因组后果最严重的损伤类型之一,其修复不利,同肿瘤等人类疾病的发生发展密切相关.新进展揭示:DSBs损伤反应信号分子ATM-Chk2-p53、H2AX等的组成性活化,是肿瘤形成早期所激活的细胞内可诱导的抗癌屏障,其信号网络的精确、精细调控在基因组稳定性维持中发挥重要作用.此外,HIV病毒整合进入宿主细胞基因组的过程也依赖于宿主细胞中ATM介导的DSBs损伤反应信号转导;ATM特异性的小分子抑制剂在抗HIV感染中显示重要的功能意义.文中重点讨论调控DSBs损伤应激反应信号网络的主要研究进展,及其在肿瘤发生、发展及抗HIV感染中的新医学意义.