复合转座子ISEcp1B与IS903介导CTX-M ESBLs新基因亚型传播机制的研究

目的研究肺炎克雷伯菌Kp49,CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)新亚型的基因环境,并分析其传播的分子机制。方法用K-B药敏法分析肺炎克雷伯菌Kp49的耐药性;用多重聚合酶链反应(PCR)技术扩增CTX-M-G1、TEM、SHV、DHA、ACT、IMP-1、VIM-1、ISEcp1B、IS903及Ⅰ类整合子,PCR扩增ISEcp1B下游的CTX-M型ESBLs全序列并测序。结果肺炎克雷伯菌Kp49只对亚胺培南敏感,对其余21种抗菌剂均耐药。检出TEM、SHV、CTX-M-G1及DHA基因Ⅰ类整合子。检出1种新的CTX-M ESBLs基因亚型,全长876 bp,与blaTX-M-14相比有1个核苷酸不同(GenBank登陆号:EF446126)。blaCTX-M-like的上游是ISEcp1B的遗传元件,下游是插入序列IS903的保守序列组成复合转座子。可能是ISEcp1B序列通过转座子机制俘获β-内酰胺酶,并提供-35及-10位点2个启动子,对下游CTX-M型ESBLs的高水平表达起重要的调控作用。结论插入序列ISEcp1B与IS903组成的复合转座子可能介导了新的CTX-M ESBLs基因亚型的水平传播,并驱使其高度表达,使Kp49对多种抗菌剂耐药。

IS606在中国人群感染幽门螺杆菌中的分布意义

目的探讨转座子插入元件IS606在中国人群感染幽门螺杆菌(Hp)中的分布特征及其与Hp致病的相关性.方法采用PCR方法,将82例临床分离培养的Hp菌株,分成IS605阳性(32株)和IS605阴性(50株)两组,扩增IS606中的1000bp片段,同时设立阳性对照及阴性对照。结果 IS606在中国人群感染Hp的82例中全部为阴性。结论作为转座子插入元件的IS606在中国人慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等不同疾病来源的Hp中均不存在。提示中国人群感染的Hp几乎无IS606插入,IS606与中国人群感染Hp的致病性似乎关系不大,且不存在IS605与IS606的双插入。

杭州市五家医院万古霉素耐药肠球菌耐药转座子结构及分子分型

目的明确万古霉素耐药肠球菌（VRE）耐药转座子结构及分子分型。方法收集2006年4月至2007年4月杭州市5家医院21株VRE菌株，用Etest法进行抗菌药物的药敏试验，并通过PCR、接合试验、质粒提取、耐药转座子结构、脉冲凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）及多位点串联重复序列分型（MLVA）进行研究。结果21株VRE基因型及表型均符合vanA。属于10个不同的PFGE型，7个不同的MLST分型，4个不同的MLVA分型，其中18株属于克隆复合体CC17，另外3株为ST343与CC17接近。所有VRE菌株均对利奈唑胺及替加环素敏感。多对引物对转座子的不同区域的PCR扩增并进行序列拼接、比对，发现其中2株VRE菌株携带典型的耐药转座子Tn1546，其余19株VRE菌株均携带一种新的与Tn1546相似耐药转座子，均在vanXY之间反向插入IS1485。18株VRE菌株均可通过滤膜接合试验进行万古霉素耐药转移，接合菌均含有约54000bp大小的质粒。结论杭州市5家医院21株VRE菌株均为vauA表型及基因型，发现了一种新的万古霉素耐药转座子结构。21株VRE菌株经MLST分型属于7个不同的序列分型，属于或接近易在医院环境里生存并在近年来迅速造成了全球播散的克隆复合体CC17。

肺炎链球菌临床菌株Tn1545和Tn917介导的大环内酯类耐药性研究

目的探讨上海地区大环内酯类耐药肺炎链球菌ermB基因表达及传播特性。方法收集上海地区对红霉素耐药的肺炎链球菌共86株,用E试验和K-B纸片扩散法检测其对12种抗生素的敏感性;用双纸片法(D试验)确定大环内酯类耐药表型;用PCR扩增检测耐药基因ermB、mefE和Tn1545、Tn917中ermB基因调控序列,经测序、BLAST比对分析调控序列多态性并按菌株携带Tn1545和Tn917的不同分为Tn1545组和Tn917组,分析二者介导的耐药表型的不同;用BOX-PCR分析不同菌株遗传背景。结果(1)86株红霉素耐药肺炎链球菌中ermB、mefE、Tn1545、Tn917检出率分别为94%、46%、87%、7%,基因型为ermB-mefE+的5个菌株未检出Tn1545和Tn917。(2)Tn1545组和Tn917组Sp大多对红霉素高度耐药(最低抑菌浓度MIC50256μg/ml),Tn917组对β内酰胺类抗生素的MIC低于Tn1545组,对四环素、复方磺胺及左氧氟沙星耐药率前者亦低于后者。(3)Tn917组中三株菌发生ermB基因启动子区194bp片段的删除和前导肽N末端TAAA插入,可能导致ermB基因由诱导型转变成组成型表达;Tn1545组菌株主要表现为cMLSB表型。(4)BOX-PCR图谱呈散发性,未发现单一的耐药克隆株流行。结论上海地区大环内酯类耐药肺炎链球菌主要是由ermB基因介导的高水平、组成型耐药,ermB基因大多由Tn1545携带并水平转移传播。

质粒介导AmpC酶的结构及传播机制研究

目的明确多重耐药肺炎克雷伯菌质粒介导的AmpC酶基因及周围序列的结构特征,阐明质粒介导AmpC酶传播机制。方法抽提接合菌的质粒,用限制性内切酶HindIII消化,酶切DNA片段的黏末端用Taq酶补平并在末端加单个的脱氧腺苷(A),与pGEM-T Easy载体进行T-A克隆。在含氨苄西林和头孢西丁的平板上筛选重组菌,抽提重组质粒,酶切分析,克隆片段用步移法测序。对重组菌进行药敏试验和等电点分析。结果克隆筛选到含5.2kb插入片段的重组质粒pT948,插入片段测序发现其含有一个ampC(blaDHA-1)基因和一个ampR调节基因。在blaDHA-1结构基因的侧翼发现一个插入序列IS26及Ⅰ类整合子的qacE△1和sulI基因。重组菌表达等电点为7.7,药敏试验显示对头孢西丁耐药,对头孢他啶的耐药性能被头孢西丁诱导。结论克隆到质粒介导的AmpC酶为DHA-1型,其相邻的插入序列IS26参与DHA-1的转移。

儿科临床分离肠球菌的耐药性监测及大环内酯类耐药机制研究

目的研究儿科临床分离肠球菌的流行情况及红霉素耐药株基因ermB、mefA、tetM与转座子整合酶基因int-Tn分布特点。方法采用KB纸片法对北京、上海、广州和重庆5家儿科专科医院2000-2006年临床分离粪、屎肠球菌进行8种抗菌药敏感性试验，并用琼脂稀释法测定225株红霉素耐药粪、屎肠球菌对大环内酯类及四环素最小抑菌浓度。PCR检测红霉素耐药基因ermB和mefA，四环素耐药基因tetM，以及转座子Tn1545的整合酶基因int-Tn。结果4地5家儿童医院分离所得肠球菌对红霉素耐药率最高，平均耐药率86．5％；对氨苄西林、高浓度链霉素、高浓度庆大霉素、环丙沙星及利福平的耐药率分别为48．0％、47．6％、60．5％、45．4％、63．6％；未发现对万古霉素耐药的肠球菌。225株红霉素耐药粪、屎肠球菌ermB基因阳性率为70．7％，仅发现1株对mefA阳性的菌株。tetM基因阳性率为75．1％。Tnl545基因阳性株组ermB和tetM的携带率分别为84．8％和83．7％，高于阴性组60，9％和70．0％，且差异均有统计学意义（P均〈0．05）。结论我国儿科临床分离粪、屎肠球菌对多种抗菌药均有较高耐药率，对糖肽类抗菌药均保持较好敏感性，分离株对红霉素和四环素耐药主要机制分别是ermB编码的靶位改变和tetM编码的核糖体保护作用；接合性转座子Tnl545与tetM和ermB存在关系密切，可能是肠球菌多重耐药的重要机制之一。

转座子piggyBac介导的HSV-tk基因在妇科恶性肿瘤细胞中长期稳定表达的研究

目的 研究piggyBac（PB）转座子介导转移外源基因HSV-tk在多种妇科恶性肿瘤细胞中的表达情况,探讨其作为一种可整合的非病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用价值.方法 通过PCR技术扩增HSV-tk基因的编码区,定向克隆至PB表达载体PB[Act-RFP]DS,经酶切、测序鉴定为重组载体PB[Act-RFP,HSV-tk]DS（pPB/TK）.联合3种小同的转染试剂FuGENE HD、jetPEI及lipofectamine 2000,分别将pPB/TK转染入4种常见的妇科恶性肿瘤细胞株HeLa、JEG-3、SKOV3和HEC-1B.转染后以mRFP1为报告基因,经荧光显微镜观察和流式细胞仪分析转染效率;逆转录（RT）-PCR技术检测HSV-tk和mRFP1基因的表达;四甲基偶氮唑蓝实验测定不同浓度的更昔洛韦（GCV）对转染后细胞的杀伤作用.转染后细胞经流式细胞仪分选,极限稀释单克隆培养建立稳定转染株,并以反向PCR技术确定转座子插入基因组的位点.结果 （1）成功构建重组载体pPB/TK.（2）在3种转染试剂的辅助下,pPB/TK均可有效转染入HeLa、HEC-1B、SKOV3和JEG-3细胞;不同转染试剂辅助下pPB/TK在同种细胞中的转染效率各不相同,在HeLa细胞中,FuGENE HD的转染效率[（78.7±9.2）%]高于lipofectamine 2000[（54.1±11.4）%]和jetPEI][（46.5±7.4）%],分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）;同一转染试剂辅助下pPB/TK在不同细胞中的转染效率也不相同,以FuGENE HD为转染试剂,pPB/TK在HeLa、JEG-3和SKOV3细胞中的转染效率分别为（78.7 ±9.2）%、（74.4±8.9）%和（83.2±9.7）%,高于HEC-1B细胞的（39.5±8.7）%,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）.（3）RT-PCR结果显示,4种细胞均有HSV-tk和mRFP1基因mRNA的表达.（4）GCV对转染有pPB/TK的HeLa、JEG-3、SKOV3和HEC-1B细胞的半数抑制浓度分别为1.29、3.35、0.09和13.28 μg/ml.10μg/ml GCV对转染有pPB/TK的SKOV3细胞抑制率高于单独转染pORF-HSVtk者,细胞抑制率分别为（86±9）%和（52±12）%,两者比较,差异有统计学意义（P〈0.05）.（5）稳定转染株在转染后3个月仍可观察到mRFP1表达,并可榆测纠基因组中有TTAA位点的插入整合.结论 PB转座子可介导外源基因在多种妇科恶性肿瘤细胞中的长期稳定表达,有望为肿瘤基因治疗提供更为安全有效的转基因技术平台.

鼠疫耶尔森菌基因组中IS100插入位点的特异性分析

目的通过鼠疫耶尔森菌基因组中插入序列IS100位点的特异性研究，对我国鼠疫菌基因组的构成类型和特点进行分析。方法以鼠疫菌东方变种C092全长序列为参考，选择5个位置的IS100位点，在IS100基因相邻两外侧设计1对引物，在IS100基因内设计1对向外引物使其分别能够与两外侧引物扩增。对来自13个生态型的91株鼠疫菌和1株假结核耶尔森菌进行PCR扩增，产物进行克隆测序分析，同时把各菌株的IS100位点情况标记在我国鼠疫疫源地类型概图上进行分析。结果实验所用91株鼠疫菌在所选定IS100位点出现含有和不含IS100的插入序列，基因片段组成相对C092序列已发生改变，而且这些IS100基因型的组成在我国鼠疫自然疫源地中呈现区域性分布。结论IS100基因型别分布与我国鼠疫菌疫源地分型分布基本一致．并直接反映了鼠疫菌基因组某特定位点的基因组成状况及其在进化过程中的高度流动性。