DNA基因甲基化检测在大肠癌诊断中的研究进展

DNA基因甲基化检测是近年来用于大肠癌(CRC)诊断的新手段之一。目前,与CRC发生和发展有关的高甲基化基因的研究较多。该文就CRC中常见的高甲基化基因,如黏结蛋白聚糖2基因、胞裂蛋白9基因、分泌型卷曲相关蛋白1基因及甲基化基因与其他常见技术联合检测的相关进展进行综述,旨在为后续探讨对CRC诊断有利的手段提供一定理论基础。

系统性硬化症合并肺间质病变患者外周血单个核细胞全基因组DNA甲基化和转录组表达谱

目的:分析系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)合并肺间质病变(interstitial lung disease,ILD)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)全基因组DNA甲基化和转录组表达谱,并进一步探讨DNA甲基化对Wnt/β-catenin信号通路和趋化因子信号通路的影响。方法:收集19例SSc患者(SSc组)及18例健康人(对照组)外周血PBMCs。SSc患者中有10例合并ILD(SSc合并ILD亚组)、9例未合并ILD(SSc未合并ILD亚组)。采用Illumina 450K甲基化芯片和Illumina HT-12 v4.0基因表达谱芯片分析全基因组DNA甲基化和基因表达水平,研究DNA甲基化对Wnt/β-catenin和趋化因子信号通路的影响。结果:全基因组DNA甲基化分析发现:与SSc未合并ILD亚组比较,SSc合并ILD亚组存在71个高甲基化位点,98个低甲基化位点。转录组分析发现:与SSc未合并ILD亚组相比,SSc合并ILD亚组有164个基因表达上调,191个基因表达下调。SSc组患者PBMCs中Wnt/β-catenin信号通路中有35个低甲基化基因,其中卷曲同源物1(frizzled-1,FZD1)、丝裂原活化蛋白激酶9(mitogen-activated protein kinase 9,MAPK9)、母亲DPP同源物2(mothers against DPP homolog 2,SMAD2)、转录因子7类似物2(transcription factor 7-like 2,TCF7L2)和无翅型MMTV整合位点家族成员5B(wingless-type MMTV integration site family,member 5B,WNT5B)mRNA在SSc组中的表达显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与SSc未合并ILD亚组比较,SSc合并ILD亚组中Dickkopf相关蛋白2(dickkopf homolog 2,DKK2)、FZD1、MAPK9等多个基因的mRNA表达虽上调,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。趋化因子信号通路中有38个低甲基化基因,其中β-抑制蛋白1(β-arrestin 1,ARRB1)、C-X-C基序趋化因子配体10(C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10)、C-X-C基序趋化因子配体16(C-XC motif chemokine ligand 16,CXCL16)、FGR、中性粒细胞胞浆因子1C(neutrophil cytosolic factor 1C,NCF1C)mRNA在SSc组中的表达显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与SSc未合并ILD亚组比较,SSc合并ILD亚组中ARRB1、CXCL10、CXCL16等多个基因的mRNA表达上调,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:SSc合并ILD与SSc无ILD患者存在DNA甲基化和转录组表达谱的差异,且SSc患者PBMCs中存在Wnt/β-catenin和趋化因子信号通路多个基因表达上调,这可能与SSc的发病机制有关。

不同氧化态叶酸对人成淋巴细胞系基因组DNA甲基化水平的影响

目的比较最高氧化态叶酸(folic acid,FA)与还原态5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate,5-MeTHF)对人成淋巴细胞LINE-1和Alu的甲基化效应,从而评价受试物对全基因组DNA甲基化的影响。方法以含30、60和120 nmol/L FA或5-MeTHF的改良RPMI1640培养液干预培养人成淋巴细胞系GM12593,20 d后提取基因组DNA,用亚硫酸盐修饰测序法(BSP)比较不同浓度和氧化态叶酸对受试细胞Alu和LINE-1甲基化水平的影响。结果基因组Alu和LINE-1甲基化水平均随FA或5-MeTHF浓度的升高而增加,两目标序列的甲基化水平在120 nmol/L FA或5-MeTHF浓度下显著高于30和60 nmol/L组(P【0.01~0.05),60和120 nmol/L的5-MeTHF提高LINE-1甲基化水平的能力显著高于同等浓度的FA(P【0.01~0.05)。结论 FA和5-MeTHF浓度与人成淋巴细胞基因组DNA甲基化水平显著正相关,5-MeTHF的基因组甲基化维护效应强于FA。

亲水作用色谱法测定组织中全基因组DNA甲基化水平

建立了亲水作用色谱（HILIC）测定组织中全基因组DNA甲基化水平的方法。采用苯酚-氯仿提取组织中的DNA,提取的DNA用88%甲酸在140℃下裂解,经N2吹干后,加乙腈-水（9∶1,v/v）溶解,用Waters BEH HILIC柱进行分离,在277nm波长下检测胞嘧啶（Cyt）及5-甲基胞嘧啶（5-mCyt）含量。结果表明,以乙腈-10mmol/L甲酸铵溶液（94∶6,v/v）为流动相,流速为0.5mL/min,Cyt与5-mCyt分离较好,保留时间分别为2.6与3.1min。胞嘧啶的线性范围为1~900μmol/L,相关系数为0.999 9;5-甲基胞嘧啶的线性范围为1~64μmol/L,相关系数为0.999 8。胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的检出限为54nmol/L（柱中为0.54pmol）,定量限为250nmol/L（柱中为2.5pmol）;在5~900μmol/L的添加水平下,胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的平均加标回收率为94.7%~100.5%,相对标准偏差小于1.48%。用该方法检测了结肠癌组织中DNA甲基化水平,结果显示该癌组织中全基因组的DNA甲基化均值为4.0%。该方法快速、简单,稳定性好,灵敏度较高,能满足全基因组DNA甲基化的检测要求。

基因组DNA甲基化在同型半胱氨酸致平滑肌细胞增殖的作用机制研究

目的探讨基因组DNA甲基化变化在Hcy致VSMCs增殖的作用机制。方法原代培养VSMCs并鉴定,用0、50、100、200、500μM浓度Hcy干预,MTT法检测VSMCs活性;SssI甲基转移酶法分析基因组DNA甲基接受能力,甲基化敏感性限制性内切酶法分析基因组DNA甲基接受能力及DNA甲基转移酶活性。结果 MTT法表明在50μM Hcy时,VSMCs活性明显增加,其余活性下降,与各浓度组并不呈量效依赖关系;Hcy可增加DNA甲基接受能力,以50μM Hcy组效应最显著(P<0.05);HpalI限制核酸内切酶消化,与对照组比较,基因组DNA甲基化接受能力减少了50.1%、41.7%、46.1%和25.5%(50、100、200、500μM Hcy组),BssHII限制核酸内切酶消化后,基因组DNA甲基化接受能力减少了约25.5%、18.1%、17.4%和18.0%(50、100、200、500μM Hcy组)。结论 Hcy引起VSMCs基因组DNA去甲基化是平滑肌细胞增殖的重要机制之一,其效应偏重发生于CpG二核苷酸序列,CpG岛所受影响相对较小,其最大效应在50μMHcy组,且无明显的量-效依赖关系。

叶酸对卵巢癌细胞基因组DNA整体甲基化及细胞行为学的影响

目的探讨叶酸对卵巢癌细胞OV90基因组DNA整体甲基化及细胞行为学的影响,为卵巢癌的防治提供理论基础。方法体外培养人卵巢癌细胞株OV90,检测不同叶酸浓度作用于癌细胞3个月后对细胞基因组DNA整体甲基化及细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。细胞分组如下:高叶酸组,叶酸浓度为40 mg/L;正常组(常规培养的细胞),叶酸浓度为4 mg/L;低叶酸组,叶酸浓度为0 mg/L。分别采用基因组DNA甲基化检测试剂盒检测基因组DNA的整体甲基化水平;CCK-8检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡的变化。结果随着叶酸浓度的增加,卵巢癌细胞基因组DNA整体甲基化水平增高;高叶酸组对癌细胞的抑制率显著高于正常组;与正常组相比较,高叶酸组卵巢癌细胞G2/M细胞百分数降低(P<0.05),S期细胞比分数升高(P<0.05),G0/G1期无明显变化(P>0.05);细胞凋亡率呈上升趋势,差异有显著性。结论一定浓度的叶酸可提高卵巢癌细胞OV90基因组DNA的整体甲基化水平,并对其生长存在一定的抑制作用。

长爪沙鼠肝脏基因组DNA甲基化水平检测

目的用间接ELISA法检测长爪沙鼠肝脏基因组DNA整体甲基化的水平。方法选取新生仔鼠6只(仔鼠组),3月龄鼠12只[其中青年对照组6只,高脂饮食诱发非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)青年模型组6只],8月龄中老龄鼠6只(中老龄),各组均为雄性,按组采集血清(新生鼠除外)用于总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)检测,同时采集肝脏标本二份,一份作常规HE染色的形态学观察,一份提基因组DNA,用ELISA法试剂盒检测肝脏基因组DNA整体甲基化的水平[即5-甲基胞嘧啶(5-mc)含量]。结果青年模型组鼠及中老龄鼠均出现高脂血症,血清TC及TG均不同程度显著上升,青年对照组鼠血脂正常。病理学检查显示,青年模型组与中老龄组鼠肝脏出现较为明显的脂肪变性,而青年对照组肝脏无异常,新生仔鼠肝血窦中可见大量成堆分布有单核细胞和红细胞。肝脏基因组DNA整体甲基化水平,青年模型组沙鼠>新生仔鼠>老龄鼠>5对照组鼠。结论长爪沙鼠NAFLD及年龄增加引起的脂肪性变程度与其基因组DNA甲基化水平相关,间接ELISA法检测肝脏基因组DNA整体甲基化水平简便、迅速,成本低,或可以作为评价其表观遗传学的一种方法。

人体结肠癌组织样品中基因组DNA甲基化水平的HPLC-ESI MS／MS检测

利用多重监测反应模式(MRM),通过对液相色谱及质谱条件的优化,建立了人体结肠癌组织样品中基因组DNA甲基化的高效液相色谱-电喷雾质谱(HPLC-ESIMS/MS)检测方法,对结肠癌组织及癌旁组织中基因组DNA甲基化进行了检测。结果表明,5-甲基脱氧胞苷(5mdC)的检出限是1pg,线性范围为0.0375～0.5mg/L,工作曲线相关系数大于0.9990,该方法的相对标准偏差为2.32%～9.21%。结肠癌病人样品检测结果表明,结肠癌组织基因组DNA甲基化水平低于相应的癌旁组织(P<0.05)。

相同空间条件下饲喂不同时间蜂王浆蜜蜂幼虫总基因组DNA甲基化水平变化

为了观察蜜蜂幼虫相同空间条件下,饲喂蜂王浆3,5,10天幼虫总基因组DNA甲基化水平,试验采用孵化同一只蜂王产的卵,孵化后获同日龄24只幼虫。第1组12只蜜蜂幼虫向工蜂方向发育,共饲喂蜂王浆3 d,然后第3天、第5天、第10天随机取3只幼虫;第2组12只蜜蜂幼虫向蜂王方向发育,整个试验过程均饲喂新鲜蜂王浆,然后第3,5,10天随机取3只幼虫,此次共18只进入试验组。按上述时间点取材,提取各组幼虫头部DNA,高效液相色谱分析DNA甲基化水平。结果表明:向工蜂方向发育的蜜蜂幼虫第5天5-甲基脱氧胞苷(5-me C)的含量明显上升,但第10天明显下降;而向蜂王方向发育的蜜蜂幼虫第5天5-me C的含量虽有明显上升,但显著低于工蜂,而且甲基化程度继续增加至第10天,5-me C的含量略高于工蜂,但差异不显著。可见向工蜂方向发育的幼虫先出现高甲基化然后在第5天出现去甲基化的现象,向蜂王方向发育的幼虫则一直处于高甲基化过程。说明相同空间条件下,饲喂不同时间蜂王浆蜜蜂幼虫间总基因组DNA甲基化水平呈现有规律的变化。

基因组DNA甲基化水平与不明原因早期自然流产的相关性

目的探讨基因组DNA甲基化水平与人不明原因早期自然流产的关系并从mRNA表达量上研究DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在自然流产绒毛DNA甲基化中的作用。方法收集45例核型正常自然流产绒毛组织及其中33例母亲外周血和44例核型正常人工流产绒毛组织及其中34例母亲外周血,采用高效液相色谱法(HPLC)测定基因组DNA甲基化水平并用荧光定量PCR法检测其中33例人工流产绒毛和30例自然流产绒毛DNMT mRNA的表达。结果 (1)自然流产绒毛组DNA甲基化水平低于人工流产绒毛组(P<0.01);(2)自然流产母亲组和人工流产母亲组间DNA甲基化水平差异无统计学意义(P>0.05);(3)自然流产绒毛组DNMT1和DNMT3AmRNA的表达低于人工流产绒毛组(P<0.05);(4)自然流产绒毛组DNMT3B mRNA的表达与人工流产绒毛组差异无统计学意义(P>0.05)。结论(1)人类早期自然流产中确实存在着绒毛组织基因组DNA甲基化的不足;(2)自然流产绒毛中DNA甲基化的不足可能与DNMT1和DNMT3A表达降低有关。

骨髓增殖性肿瘤患者DNA甲基化基因突变及临床特征分析

目的:分析骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者DNA甲基化基因突变情况,初步探讨其临床特征。方法:采用二代测序技术检测105例MPN患者[真性红细胞增多症(PV)40例,原发性血小板增多症(ET)65例]的31种MPN相关基因,分析患者DNA甲基化基因突变与临床特征的关系。结果:105例患者中检出15种突变共88个突变,总突变检出率为87.6%(92/105)。22例患者检出4种DNA甲基化基因(TET2、DNMT3A、IDH1、IDH2)共23个突变。DNA甲基化基因突变率为21.0%,主要以双突变形式共存,包括JAK2 V617F和TET2(n=10)、JAK2 V617F和DNMT3A(n=4)、CALR和TET2(n=2)、JAK2 V617F和IDH1(n=1)。与无DNA甲基化基因突变的MPN患者相比,DNA甲基化基因突变的女性患者比例及白细胞数(WBC)显著升高(P<0.05)。与驱动基因三阴性的MPN患者相比,DNA甲基化基因突变的女性患者比例、年龄、WBC、血小板数(PLT)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)均显著升高(P<0.05)。其余比较差异均无统计学意义(P>0.05)。DNA甲基化基因突变患者的MPN10评分、血栓事件发生率、中高危患者比例显著高于无DNA甲基化基因突变的MPN患者(P<0.05)。结论:DNA甲基化基因突变率为21.0%,主要以双突变形式共存。DNA甲基化基因突变的MPN患者女性比例及WBC高,症状负荷重,血栓发生率高,中高危患者比例高,提示其预后可能较差。

肺形侧耳退化与基因组DNA 甲基化关系的探讨

以肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)菌株秀2、秀t 2、秀tz 2为供试菌株,通过拮抗实验、ISSR和RAPD多态性分析研究3个供试菌株间的亲缘关系;比较3个菌株在菌丝生长速度、产量以及基因组DNA甲基化率三个方面的差异,以揭示菌株退化与基因组DNA甲基化的关系;通过5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC)去甲基化处理菌株后,检测其基因组甲基化率,并将去甲基化处理菌株继代4次后测定甲基化率和菌丝生长速度。结果表明:秀t 2与秀tz 2、秀2与秀tz 2、秀t 2与秀2均无拮抗反应,ISSR和RAPD扩增产物经过分析后得出3个菌株亲缘关系接近;与秀t2相比,秀2、秀tz2的菌丝生长速度和第一潮产量均显著提高,基因组DNA甲基化率均显著降低。经过20 mmol·L^(-1 )5-azaC去甲基化后,与对照组(CKF1)相比,处理组(20 F1)基因组DNA甲基化率显著降低、菌丝生长速度显著提高,推测肺形侧耳菌株退化与其基因组DNA甲基化存在联系。5-azaC处理肺形侧耳,其基因组甲基化率会降低,经过4次继代后,DNA甲基化率会逐步提高,表明继代培养可能引起菌株退化。

质谱法定量生态物种基因组DNA低甲基化

为了定量生态相关物种基因组中低丰度的5-甲基-2-脱氧胞苷(5-mdC),建立了一种采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)的无标记方法.全基因组DNA甲基化计算公式5-mdC(mole)/(5-mdC(mole)+dC(mole)可以转化为1/(1+dC(mole)/5-mdC(mole)),然后通过HPLC-MS/MS得到DNA样品中5-mdC和dC的物质的量比(dC(mole)/5-mdC(mole))即可得到基因组DNA甲基化值.此外,还对HPLC条件进行了优化使正常核苷和修饰核苷基线分离,消除分析物的交叉干扰.本方法避免了使用昂贵的稳定同位素标记内标,在等度高效液相色谱条件下实现了正常和修饰核苷基线分离,5-mdC和dC的保留时间分别为5.50和3.06min.5-mdC和dC的定量限分别为14.2和19.1pg/mL.日内和日间偏差和准确性(相对误差)都≤10%.该方法测定的小牛胸腺DNA和大型蚤及秀丽线虫的全基因组DNA甲基化值分别为(6.44±0.25)%,(0.097±0.010)%和(0.025±0.002)%.采用HPLC-MS/MS技术建立并验证了一种快速、高精密度和灵敏度的DNA样品全基因组DNA甲基化测定方法,适用于评估环境污染物对生态学相关物种的潜在表观遗传风险.

生物钟基因DNA甲基化水平及动态变化与老年失眠障碍关联的巢式病例

目的探讨生物钟基因DNA甲基化水平及动态变化与老年失眠障碍关联的巢式病例。方法选择2018年4月-2019年7月老年患者1500例作为对象,所有患者入院后采用阿森斯失眠量表对患者睡眠情况进行调查,根据评估结果分为失眠障碍组和睡眠良好组。查阅两组病例资料,记录患者性别、年龄、家庭经济、饮酒、超重/肥胖、冠心病史及胃溃疡病史等并完成单因素、多因素Logistic分析;采用实时荧光PCR(RT-PCR)方法测定两组生物钟基因CLOCK、PER、CRY基因的mRNA表达水平,并与老年障碍完成相关性分析。结果老年患者1500例中失眠障碍患者424例,发生率为28.27%。单因素及多因素Logistic分析结果表明:老年失眠障碍发生率与饮酒、超重/肥胖、年龄具有统计学意义(P<0.05);失眠障碍组生物钟基因CLOCK mRNA水平高于睡眠良好组(P<0.05);失眠障碍组生物钟基因PER、CRY基因的mRNA表达水平低于睡眠良好组(P<0.05);Pearson相关性分析结果表明:老年失眠障碍发生率与生物钟CLOCK呈正相关性(P<0.05);与PER、CRY基因呈负相关性(P<0.05)。结论老年失眠障碍发生率较高,受到的影响因素较多,且与生物钟基因DNA甲基化及动态变化存在相关性,加强其表达水平测定能预测老年失眠障碍发生率。

慢性肾功能衰竭大鼠肾皮质基因组DNA表观遗传学变化的MSAP分析

以灌胃腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭Wistar大鼠为实验材料,用高效液相色谱法(HPLC)检测了大鼠血清Hcy浓度的变化;应用甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术,检测了慢性肾衰大鼠肾皮质基因组DNA甲基化程度的变化,并对MSAP差异片段进行了分析.结果发现:(1)慢性肾衰大鼠血清Hcy浓度由正常的(10.56±1.20)μmol/L上升为(16.64±1.57)μmol/L,P<0.05,差异具有显著性.(2)慢性肾衰大鼠肾皮质基因组总甲基化率由正常的(41.95±1.94)%降低为(38.43±3.27)%,P<0.05,差异具有显著性.(3)甲基化差异片段涉及多个基因,其中包括多个甲基化转移酶相关基因.结果表明慢性肾功能衰竭大鼠会出现高同型半胱氨酸血症和肾皮质基因组总甲基化水平的降低,多个基因内部或上下游DNA序列出现甲基化状态变化.

质谱技术在DNA甲基化研究中的应用

DNA甲基化是最重要的表观遗传修饰之一,主要发生在哺乳动物基因组Cp G核苷酸序列中的胞嘧啶C-5位点,并与机体生长发育、转座子沉默、X染色体失活及许多疾病的发生相关。但对DNA甲基化的形成、维持和重构的分子机制的认识是有限的,需要从基因组水平寻找最优的DNA甲基化定性和定量分析方法,而质谱技术以高敏感性、高通量、高准确率、高分辨率、快速且重复性好等优势在该研究领域具有较大的应用价值。介绍质谱技术在全基因组DNA甲基化和启动子区甲基化分析中的应用。

胃癌组织中Syk基因甲基化状态及临床意义

目的探讨胃腺癌患者肿瘤组织、癌旁组织中Syk基因的甲基化状态与临床病理特征及预后的关系。方法应用Real—time甲基化特异性聚合酶联反应技术（MSP）检测92例胃腺癌患者肿瘤组织、配对的癌旁组织中Syk基因的甲基化状态，并分析其与临床病理因素及预后之间的关系。选取40例年龄对应的健康志愿者及48例非萎缩性胃炎患者胃镜获取的组织DNA作对照。结果胃腺癌患者肿瘤组织中检测到Syk基因甲基化有33．7％（31／92），明显高于癌旁组织54％（5／92）。健康对照者和胃炎患者均无Syk基因甲基化。Syk基因甲基化与肿瘤大小、生长方式、分化程度、是否有静脉或淋巴管侵犯、TNM分期有关（17〈005）。结论胃腺癌患者Syk基因甲基化与肿瘤的生物学行为有关，提示肿瘤进展，预后不佳。

大鼠总基因甲基化状态改变相关危险因素的研究

目的:探讨高胆固醇血症(Hypercholesterolemia,HTC)对wistar大鼠主动脉基因组DNA总甲基化水平及总甲基转移酶活力的影响并比较高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHCY)和HTC在影响主动脉基因组DNA总甲基化水平、总甲基转移酶活力之间的差异。方法:将wistar大鼠33只,随机分3组:对照组、蛋氨酸组、高胆固醇组,每组11只。对照组给予普通大鼠饲料,其余各组给予相应的配方饲料。持续喂养3个月后心脏取血检测血清同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)等相关指标。提取主动脉基因组DNA检测基因组DNA总甲基化水平、提取主动脉核蛋白检测基因组DNA总甲基转移酶活力。结果:经多个样本均数间的多重比较(Dunnett-t检验):高胆固醇组大鼠的血清TC水平明显高于对照组和蛋氨酸组,且差异有统计学意义(P<0.05),血清中甘油三酯(Triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein-cholesterol,HDL-C),差异无统计学意义(P>0.05)。蛋氨酸组大鼠血清Hcy水平明显高于对照组及高胆固醇组,且差异有统计学意义(P<0.05)。HHCY和HTC均增加基因组DNA总甲基转移酶活力,可促使基因组DNA去甲基化,与对照组相比,各组均具有统计学意义(P<0.05),但两组之间差异无显著性。结论:HTC降低大鼠主动脉基因组DNA总甲基化水平可能是HTC导致动脉粥样硬化发病重要机制之一,且HHCY和HTC在影响基因组DNA低甲基化之间的差异无显著。

DNMT3a通过提升基因内部甲基化介导紫杉醇诱导的LINE-1异常表达

药物诱导的长散在重复序列LINE-1异常激活可促进细胞基因组不稳定,而基因组不稳定是促进肿瘤发生发展和耐药表型形成的重要因素。因此,探索LINE-1异常激活的分子机制具有重要的理论和临床意义。DNA甲基化是调控基因表达的重要方式,已知DNA甲基转移酶家族成员DNMT3a不仅能通过促进基因启动子甲基化抑制基因表达,还可通过增强基因内部甲基化上调基因表达。本实验室前期研究发现,将乳腺癌细胞暴露于化疗药物可诱导LINE-1异常高表达,但LINE-1启动子甲基化水平并无显著改变。本研究进一步探讨了在化疗药物压力下DNMT3a是否可通过增强LINE-1基因内部甲基化水平促进LINE-1在乳腺癌细胞中的异常高表达。ChIP实验和甲基分析结果显示,用化疗药物紫杉醇(PTX)处理乳腺癌细胞,不仅可以诱导DNMT3a表达,而且可以促进DNMT3a与LINE-1基因内部区域的结合,提升其基因内部甲基化水平,进而上调LINE-1的表达水平。利用表达载体增加细胞内DNMT3a的表达水平,可显著上调LINE-1基因内部的甲基化及基因的表达水平,而下调DNMT3a的表达可有效抑制LINE-1表达。上述研究结果表明,DNMT3a介导的基因非启动子区甲基化在药物诱导的LINE-1异常激活中发挥重要作用,为认识LINE-1在乳腺癌化疗耐药性形成过程中异常激活的机制提供了新思路。

柯乐猪血液基因组甲基化修饰与细胞因子水平的相关性

为探明柯乐猪血液免疫细胞的基因表达是否受甲基化调控,应用甲基化敏感扩增多态性技术(MSAP)和酶联免疫吸附测试技术(ELISA)对柯乐猪与大白猪血液基因组DNA的甲基化水平、血清中的细胞因子浓度进行检测,分析柯乐猪与大白猪在甲基化水平、细胞因子浓度方面的差异及其相关关系。结果表明:柯乐猪基因组总甲基化水平为32.38%,与大白猪接近(P>0.05);IL-2、IL-4、IL-6和IL-10浓度分别为(302.37±125.72)pg/mL、(88.71±32.05)pg/mL、(219.01±30.42)pg/mL和(116.95±30.24)pg/mL,其中IL-6和IL-10分别极显著、显著低于大白猪;IFN-α、IFN-γ分别为(211.09±76.08)pg/mL和(57.18±14.21)pg/mL,分别极显著、显著高于大白猪。柯乐猪基因组的全甲基化水平与IFN-γ浓度间呈弱负相关关系(ρ=-0.256)。说明,血液免疫细胞的基因表达可能受甲基化的调控,且与柯乐猪的抗病力强有关。