DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1(TopBP1)磷酸化功能位点推测及功能分析

为阐明DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1(TopBP1)参与DNA损伤修复应答的分子机制,本研究通过生物信息学分析,发现多个潜在的TopBP1磷酸化位点T860,S887,T1104及T1167,利用分子生物学手段从人cDNA文库中扩增并获得TopBP1克隆质粒,将上述磷酸化位点突变为丙氨酸,观察突变质粒转染细胞对DNA损伤修复的应答反应.结果显示,在粒子射线照射或化疗药物处理细胞后,第1104丙氨酸突变(T1104A)的TopBP1蛋白导致pRPA32-S33的磷酸化水平大幅降低,同时细胞周期检验点失活,严重阻滞了DNA应激反应,证实T1104是TopBP1参与DNA损伤修复的关键活性位点.

脱氧核糖核酸拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1与肿瘤的研究进展

脱氧核糖核酸(DNA)损伤应答(DDR)是维持内稳态及肿瘤发展重要机制之一。DNA拓扑异构酶Ⅱβ结合蛋白1(TopBP1)在维持基因组稳定性及调控DDR相关信号通路中扮演着关键角色。最新研究发现,TopBP1通过多种分子机制促进肿瘤细胞的生长、转移及耐药,并且与肿瘤发病风险及预后显著相关。本文对TopBP1在乳腺及妇科、呼吸及消化系统肿瘤中的最新研究进展进行综述,以期深入了解TopBP1在不同肿瘤中的作用机制,推动其转化为临床标志物或药物干预靶点,并为基于DDR的抗癌策略提供新思路。

口腔癌组织中HIF-1α的表达及其与肿瘤耐药蛋白表达关系的研究

目的:探讨口腔癌中缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)及肺耐药蛋白(LRP),DNA拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ),谷胱甘肽-s-转移酶-π(GST-π)的表达及其相关性。方法:采用免疫组化(SP法)技术检测57例口腔癌组织中HIF-1α、LRP、TOPOⅡ、GST-π蛋白的表达。结果:HIF-1α、LRP、TOPOⅡ及GST-π蛋白表达阳性率分别为63.16%、45.61%,38.60%和57.90%。HIF-1α的表达与淋巴结转移、临床分期相关,与LRP、GST-π的表达呈正相关关系,而与TOPOⅡ无明显相关性;LRP的表达与临床分期有关,GST-π与淋巴结转移有关。结论:口腔癌缺氧微环境通过HIF-1α影响肿瘤耐药相关蛋白的表达,联合检测为口腔癌的综合治疗方案的制定有临床意义。

TopBP1多克隆抗体的制备及初步鉴定

研究以人cDNA文库为模板,构建重组质粒pET41a-TopBP1,在原核表达菌株BL21中通过IPTG诱导,表达并经GST亲和纯化重组蛋白TopBP1-GST,免疫家兔后制备多抗血清,并采用Western-Blot检测其效价和特异性,为TopBP1在DNA损伤修复中的研究奠定基础.结果显示在表达受体菌株BL21中成功表达并纯化了TopBP1-GST重组蛋白,免疫家兔并获得了高效价的多抗血清,利用Western-Blot也证实了抗体特异性,并能识别出经CPT处理后的特异性磷酸化条带.以上表明,高效价的兔抗人TopBP1血清抗体制备成功,为TopBP1相关领域的研究提供了技术支撑.

血小板衍生生长因子受体-β信号促进突变型p53介导MDA-MB-231细胞阿霉素耐药

目的探讨血小板衍生生长因子受体-β(platelet-derived growth factor receptor-beta,PDGFR-β)信号与三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞阿霉素耐药的关系及机制。方法采用流式细胞术、MTS法检测PDGF-DD(PDGFR-β特异性配体)对阿霉素所致的细胞G_2期阻滞、细胞凋亡及死亡情况的影响;qPCR和Western blot检测突变型p53、cdk1、PDGFR-β、p21、bax、hsp90及TopBP1表达水平,以研究PDGF-DD、Wortmannin(PI3K抑制剂)对突变型p53及其功能的影响;利用siRNA干扰技术、qPCR探讨突变型p53、PDGF-DD和耐药相关基因表达的关系。结果 PDGF-DD明显提高阿霉素条件下细胞存活率、降低细胞凋亡率、一定程度改善细胞G_2期阻滞,显著提高突变型p53蛋白水平并改变其下游基因cdk1、PDGFR-β、p21、bax表达,但突变型p53 mRNA变化差异不具统计学意义(P>0.05)。PDGF-DD显著上调hsp90(突变型p53蛋白稳定因子)和TopBP1(突变型p53功能促进蛋白)mRNA和蛋白水平,Wortmannin处理后表达明显下降。PDGF-DD明显提高耐药相关基因FOXC2、twist、snail、nanog、oct4mRNA水平,p53 siRNA处理后mRNA表达显著下降。结论 PDGF-DD/PDGFR-β信号能诱导MDAMB-231细胞发生阿霉素耐药,通过PI3K途径转录水平上调hsp90和TopBP1表达、稳定并促进突变型p53介导细胞耐药是其重要机制之一。

肿瘤耐药相关基因对骨肉瘤新辅助化疗耐药的评估价值

目的探究第10号染色体缺失性磷酸酶-张力蛋白同源物基因(PTEN)、DNA拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)、多药耐药基因1(MDR1)对骨肉瘤新辅助化疗耐药的评估价值。方法选取2020年7月至2022年7月在河北省张家口市第一医院确诊并治疗的106例骨肉瘤患者,根据新辅助化疗结果分为化疗敏感组(74例)和化疗耐药组(32例)。采用免疫组织化学染色法、蛋白质印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PTEN、TOPOⅡ、MDR1蛋白表达情况。采用Logistic回归模型分析骨肉瘤新辅助化疗耐药的影响因素。采用受试者工作特征曲线分析外周血PTEN、TOPOⅡ、MDR1 mRNA表达水平对骨肉瘤新辅助化疗耐药的评估价值。结果免疫组织化学染色结果显示,化疗耐药组PTEN阳性表达率低于化疗敏感组(P<0.05),TOPOⅡ、MDR1阳性表达率均高于化疗敏感组(均P<0.05)。蛋白质印迹法结果显示,化疗耐药组PTEN表达量低于化疗敏感组,TOPOⅡ和MDR1表达量均高于化疗敏感组(均P<0.05)。RT-PCR法结果显示,化疗耐药组PTEN mRNA表达水平低于化疗敏感组[(0.34±0.07)比(2.87±0.69)],TOPOⅡ、MDR1 mRNA表达水平均高于化疗敏感组[(3.22±0.77)比(0.86±0.21),(3.00±0.67)比(0.94±0.23)](均P<0.05)。结论PTEN、TOPOⅡ、MDR1联合检测对骨肉瘤新辅助化疗耐药有较好的评估作用,这对于早期筛选出新辅助化疗耐药患者有重要的指导意义。