有氧运动对青年期小鼠海马体Cdc42及DNA损伤反应相关因子的短期和长期影响

目的:探讨有氧运动对青年期小鼠海马体细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle protein 42,Cdc42)及DNA损伤反应(DNA-damage response,DDR)相关因子的短期和长期影响。方法:构建运动小鼠模型,将40只8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为安静组和运动组,每组20只,均使用普通饲料喂养。运动组小鼠进行12周的中等强度(75%VO_(2)max)跑台运动,安静组小鼠在不跑步的情况下暴露于跑步机噪声和振动中。12周训练结束后,从安静组和运动组中随机选取小鼠各10只(5月龄),分别为安静青年期小鼠(Sed-young)组和运动青年期小鼠(Exe-young)组;剩余的10只安静组小鼠和10只运动组小鼠继续喂养至老年期(18月龄),作为安静老年期小鼠(Sed-old)组和运动老年期小鼠(Exe-old)组。所有小鼠均收集Y迷宫、体成分数据及海马体组织,通过Cdc42活性检测和Western blot法比较各组小鼠海马体Cdc42-GTP活性及Cdc42蛋白表达情况,通过RT-qPCR比较各组小鼠海马体Cdc42、Pak4、Pak5、Cofilin、Chk2、Atm和P53等DDR相关因子的mRNA水平。结果:与安静组比较,有氧运动可显著降低青年期小鼠脂肪百分比(P<0.05),显著提高空间识别记忆能力(P<0.05),并维持至老年期(P<0.05)。与安静组比较,运动青年期小鼠和运动老年期小鼠海马体Cdc42表达及活性均显著降低(P<0.05)。与安静组比较,有氧运动显著降低青年期小鼠海马体Cdc42、Pak4、Pak5、Cofilin、Atm、Chk2和P53的转录水平(P<0.05);其中,Cdc42、Pak4、Pak5、Cofilin、Chk2和P53的转录水平下降可维持至老年期(P<0.05)。结论:青年期进行的有氧运动可持续抑制小鼠海马体Cdc42及DDR相关因子的表达,保护海马体神经元细胞免受DNA损伤而死亡或衰老直至老年期。

DNA损伤生物学反应中ATM对p21^(WAF1/CIP1)蛋白的直接磷酸化

毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白 (mutatedinataxiatelangiectasia ,ATM)是直接感受DNA双链断裂损伤并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子 .已有研究发现 ,DNA损伤生物学反应中 ,ATM可通过磷酸化活化p5 3,继而转录活化细胞周期检查点蛋白p2 1WAF1 CIP1的表达 ,而对于ATM是否直接参与p2 1WAF1 CIP1的早期活化迄今尚无实验证明 .通过免疫共沉淀反应 ,检测到细胞电离辐射 (ionizingradiation ,IR)反应早期ATM与p2 1WAF1 CIP1蛋白存在相互作用 .将p2 1WAF1 CIP1蛋白编码基因全长克隆入原核表达载体pGEX4T 2 ,经诱导表达及亲和层析纯化获取GST p2 1融合蛋白作为磷酸化底物 .体外磷酸化实验检测证明 ,IR活化的ATM具磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白的功能 ,并且此磷酸化功能可被PI3K家族特异性抑制剂Wortmannin所抑制 .结果揭示了IR后ATM可通过直接磷酸化p2 1WAF1 CIP1蛋白 ,在IR致DNA损伤生物学反应早期调控p2 1WAF1

莪术油对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及DNA损伤反应的调控作用

目的研究莪术油通过hTert作为下游靶基因对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及DNA损伤反应的调控作用。方法以300μg/mL莪术油处理MCF-7细胞,采用MTT法测定细胞增殖活性,绘制生长曲线,筛选最佳药物处理时间。于加药后48 h,实时定量RT-PCR检测端粒酶催化亚单位hTert表达水平、TRAP Assay检测端粒酶活性变化;收集加药前以及加药后24,48,72 h细胞,采用免疫荧光及Western Blot检测DNA损伤反应相关53BP1蛋白水平。结果莪术油处理的MCF-7细胞24 h后增殖活力开始降低,至48 h生长明显减缓,实时定量RT-PCR结果表明,加药后48 h,hTert表达水平降低为对照细胞的2.43倍(2-△△Ct),TRAP Assay结果显示端粒酶活性降低为对照细胞的2.27倍,免疫荧光及Western Blot结果显示莪术油处理的细胞53BP1蛋白磷酸化水平自转染24 h后开始升高,至48 h左右达到高峰,至72 h时仍保持在较高水平。结论莪术油可以hTert作为下游靶分子,通过调控端粒酶活性及DNA损伤反应,抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖。

DNA双链断裂损伤反应及它的医学意义

DNA损伤应激反应是维持基因组稳定性的基石.细胞在长期进化中形成了由损伤监视、周期调控、损伤修复、凋亡诱导等在内的自稳平衡机制.一方面,借助感应、识别并启动精细而复杂的修复机制修复损伤;另一方面,通过DNA损伤应激活化的细胞周期检查点机制,延迟或阻断细胞周期进程,为损伤修复提供时间,使细胞能安全进入新一轮细胞周期;损伤无法修复时则诱导细胞凋亡.DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)是真核基因组后果最严重的损伤类型之一,其修复不利,同肿瘤等人类疾病的发生发展密切相关.新进展揭示:DSBs损伤反应信号分子ATM-Chk2-p53、H2AX等的组成性活化,是肿瘤形成早期所激活的细胞内可诱导的抗癌屏障,其信号网络的精确、精细调控在基因组稳定性维持中发挥重要作用.此外,HIV病毒整合进入宿主细胞基因组的过程也依赖于宿主细胞中ATM介导的DSBs损伤反应信号转导;ATM特异性的小分子抑制剂在抗HIV感染中显示重要的功能意义.文中重点讨论调控DSBs损伤应激反应信号网络的主要研究进展,及其在肿瘤发生、发展及抗HIV感染中的新医学意义.

DNA损伤修复能力对辐射适应性反应的影响

采用野生型的中国仓鼠卵母细胞(CHO-9)及其DNA损伤修复缺陷型细胞:EM-C11(DNA单链断裂修复缺陷)和XR-C1(DNA双链断裂修复缺陷),首先进行低剂量(0.016Gy或0.08Gy)的初始照射,间隔4h或7h后再进行高剂量(1Gy)的攻击照射,然后检测细胞微核形成率和克隆形成率的变化。结果显示:当初始剂量为0.08Gy,间隔4h后再施以1Gy的攻击照射时,三株细胞只有野生型的CHO-9有辐射适应性反应产生;但当间隔时间延长到7h时,CHO-9和EM-C11均产生了辐射适应性反应。当把初始照射剂量降低为0.016Gy,间隔4h再施以1Gy的攻击照射时,三株细胞均产生了辐射适应性反应。表明辐射适应性反应不仅与初始照射剂量及间隔时间有关,还与DNA损伤修复密切相关。

TPX2在细胞间期参与DNA损伤反应及其与肿瘤发生关系的研究进展

经过多年的研究,TPX2（targeting protein for Xklp2）被认为是与细胞有丝分裂和纺锤体组装相关的一个重要因素,在细胞周期的S和G2期优先存在于细胞核中。由于TPX2在多种癌症中存在高表达,它的异常表达可导致细胞中心体异常扩增、异倍体形成以及细胞癌变的发生,在恶性肿瘤的发生发展中起到原癌基因的作用,进而促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、增强其侵袭及转移性。

UV反应不一定等同于DNA损伤反应

哺乳类细胞遭受紫外线（ＵＶ）和其他ＤＮＡ损伤剂作用后短时间内出现的基因转录诱导称为ＵＶ反应过去认为这种反应是ＤＮＡ损伤的结果．但是近年来的一些研究对这一观点提出了不少质疑，因而有必要在此讨论几个产生争议的主要问题。

应用依赖随机化末端连接物聚合酶链反应技术研究重铬酸钾对大鼠肺p53基因DNA损伤

应用依赖随机化末端连接物PCR(RandomizedTerminalLinker-dependentPCR ,RDPCR)技术于体内试验的研究 ,从而检测特定基因的DNA损伤。腹腔注射重铬酸钾染毒大鼠 ,提取肺组织基因组DNA ,经p5 3基因外显子 7特异性引物P1重复直线延伸后与接头 (Linker)连接 ,用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR扩增 ,电泳、转印 ,再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果显示 ,在 2 0 .0mg kg和 40 .0mg kg剂量下 ,出现了两条清晰的杂交带 ,表明重铬酸钾可引起大鼠肺p5 3基因外显子 7的DNA损伤 ,且有两个损伤位点。此结果有助于进一步探讨六价铬化合物的致突变机制 。

抑制端粒保护蛋白TPP1表达诱导ATM依赖的DNA损伤反应

目的:构建端粒保护蛋白TPP1短发夹RNA表达载体,探讨抑制TPP1表达后对端粒DNA损伤及细胞增殖的影响.方法:体外构建端粒保护蛋白TPP1shRNA逆转录病毒表达载体shTPP1-01,shTPP1-02,与表达外源性TPP1的TPP1-HA质粒共同转染293T细胞,Western Blot检测shTPP1抑制外源性TPP1蛋白表达;RT-PCR检测shTPP1抑制小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)内源性TPP1mRNA的表达.再用shTPP1分别感染ATM+/+MEF和ATM-/-MEF细胞后,分别采用细胞生长曲线和BrdU掺入法检测细胞增殖,免疫荧光/端粒肽核酸荧光原位杂交法(IF/PNA-FISH)检测端粒功能障碍诱导损伤灶(TIF)的形成.结果:shTPP1-01和shTPP1-02均能明显抑制外源性TPP1蛋白和内源性TPP1mRNA的表达,shTPP1-01和shTPP1-02作用于原代培养的MEFs后细胞生长缓慢,BrdU阳性细胞数量分别占8.0%和8.7%,显著低于对照细胞的29.3%(P<0.01,P<0.01);而细胞表现为体积变大,形态扁平等类似细胞衰老的形态学改变;IF/PNA-FISH法检测结果显示,shTPP1作用于ATM+/+MEF细胞后导致端粒DNA损伤标志物-磷酸化的H2AX(γ-H2AX)和53BP1损伤灶(TIF)的形成,定量结果显示约50%的ATM+/+细胞中出现至少5个TIF;而在shTPP1作用后的ATM-/-细胞中,端粒γ-H2AX和53BP1形成的TIF数量显著减少,出现5个TIF的细胞数量不足5%,与对照组细胞相比无显著性差异.结论:抑制TPP1表达后诱发端粒ATM依赖的DNA损伤反应,进而抑制细胞增殖,促进细胞衰老.

土槿皮乙酸通过DNA损伤反应诱导细胞自噬来抑制凋亡

目的本课题在人肺成纤维细胞MRC5中研究土槿皮乙酸(PAB)诱导的DNA损伤反应、自噬及其与凋亡的关系。方法以4 mmol/L PAB分别处理12、24、36、48 h后,Western blot分析DNA损伤反应标志蛋白g-H2AX表达;通过酰尸胺染色法、Western blot法确定PAB是否诱导细胞自噬;通过抑制DNA损伤反应的发生确定DNA损伤反应对自噬和凋亡的影响。结果 PAB诱导DNA损伤反应;PAB诱导细胞自噬;抑制DNA损伤反应抑制细胞自噬并促进细胞凋亡。结论 PAB通过诱导DNA损伤反应诱导细胞自噬,抑制自噬促进细胞凋亡并增加PAB的抑制率。

胞外信号调节激酶促进DNA损伤反应的作用机制

机体在长期进化中拥有一整套DNA损伤反应(DNA damage response,DDR)系统来保证基因组的完整性,其中最重要的就是通过激活检验点以阻止细胞周期进程,并修复损伤的DNA。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是经典的细胞信号转导通路,具有调节细胞增殖、分化、凋亡等多种功能,二者的功能性联系都能调节细胞增殖。本综述旨在阐述ERK激酶在DNA损伤反应中的作用。

靶向DNA损伤反应途径:PARP抑制剂抗肿瘤治疗研究进展

细胞在长期进化过程中形成的复杂的DNA损伤反应防御机制是维护基因组稳定性的重要途径,DNA损伤反应通路缺陷可导致包括肿瘤在内的多种疾病的发生。DNA损伤反应通路是一个复杂的信号通路,包括DNA损伤修复、凋亡、细胞周期调控等,DNA损伤反应通路已经成为新的抗肿瘤药物靶点。目前,已经开发多种DNA损伤反应通路相关的抑制剂,特别是对BRCA1和BRCA2基因突变的肿瘤,利用协同致死现象而开发的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂广泛应用于肿瘤个体化治疗。该文重点对DNA损伤反应通路抑制剂中的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的作用分子机制、临床治疗、耐药性以及面临的挑战进行综述。

干扰hTERT降低人乳腺癌MCF-7细胞对γ射线引起的DNA损伤反应

目的研究hTERTRNA干扰对人乳腺癌MCF-7细胞γ射线照射引起的DNA损伤反应的影响。方法通过反转录病毒为载体的hTERT-siRNA,抑制人乳腺癌MCF-7细胞中端粒酶催化亚单位hTERT表达,实时定量RT-PCR及Western blot确认hTERT表达水平。用137Cs放射源以3 Gy剂量γ射线照射细胞,于照射前以及照射后1、2、4、8和12 h收集细胞,采用磷酸化53BP1抗体进行免疫荧光染色,并于照射前、照射后1、4和12 h收集细胞,Western blot检测53BP1蛋白磷酸化水平。结果 hTERT-siRNA处理的细胞hTERT表达水平比对照细胞降低3.20(2-△△Ct)倍,hTERT蛋白水平降低2.56倍。hTERT-siRNA处理的细胞对γ射线引起的DNA损伤反应显著降低。结论 RNA干扰hTERT表达水平,可以降低人乳腺癌MCF-7细胞对γ射线照射引起的DNA损伤反应。

RAP80在DNA损伤反应中的作用

DNA在遭受电离辐射、类辐射性药物、化学损伤等刺激后会发生DNA双链断裂（Double-strand break,DSB）,此时DNA损伤反应（DNA damage response,DDR）调控激活一系列细胞周期检查点、DNA修复网络并促使凋亡反应发生,以确保精确修复损伤位点,维持基因的完整性.许多研究报道,受体相关蛋白80（receptor-associated protein 80,RAP80）在DNA损伤反应中有着重要作用,可促使一系列修复蛋白定位到正确的DNA损伤位点.现对RAP80在DNA损伤反应中的作用综述如下.

发育及DNA损伤反应调节基因1的研究进展

发育及DNA损伤反应调节基因1(regulated in development and DNA damage responses 1,REDD1)又称为RTP801,是一个新近发现的低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)靶基因,在细胞和整体动物缺氧缺血模型中其表达显著升高,随着研究的深入,发现其对多种细胞刺激均能产生应激反应,在细胞凋亡过程中发挥着重要的调节作用;RTP801受到多种细胞信号通路的调控,研究其功能和作用机制可为临床缺血性疾病和肿瘤的防治等提供新的思路。

癌基因诱发的DNA损伤反应与肿瘤生成

肿瘤的发生与癌基因的激活或抑癌基因的失活有着密不可分的关系.癌基因的活化及抑癌基因的抑制可引发细胞内染色体基因组的复制应激反应.持续的复制应激反应可导致双链DNA断裂或单链DNA复制中间体的产生,从而分别激活两个重要的DNA损伤反应(DDR)通路,即ATM和ATR通路.与此同时,DDR检查点在感知DNA损伤信号后,可诱发细胞周期阻滞.只有损伤的DNA在得以正确修复以后,细胞周期才能再次启动.在细胞发生肿瘤转化的情况下,癌基因在引发DNA损伤的同时,常通过多种途径抑制DDR反应,导致染色体异常的重组与分离,进而促进肿瘤的生成;而癌基因造成的持续的损伤反应,未通过DDR检验点,还可引发细胞的另外一种结局,即最终细胞的老化死亡.

软脂酸对阿霉素诱导的原代MEF细胞DNA损伤反应的调节

目的探讨软脂酸是否影响原代MEF细胞的DNA损伤反应。方法利用western方法检测原代MEF细胞p53及p-p53蛋白的表达变化,判断软脂酸是否影响原代MEF细胞的DNA损伤反应。结果(1)软脂酸抑制阿霉素诱导的原代MEF细胞p53蛋白的表达。(2)软脂酸抑制阿霉素诱导的原代MEF细胞p53蛋白的磷酸化。结论软脂酸可能通过抑制DNA损伤反应,有利于损伤细胞转化为肿瘤细胞。

c-Abl在DNA损伤反应中的功能

非受体酪氨酸激酶c-Abl在正常生理及病理条件下具有多种生物学功能。当电离辐射、顺铂、丝裂霉素C等DNA损伤诱导剂诱导DNA损伤反应后,c-Abl可参与DNA损伤反应后的细胞周期调控、基因重组修复及细胞凋亡调控等,进而决定细胞在DNA损伤反应条件下的状态。简要介绍了c-Abl在DNA损伤反应中的作用及其进展。

快速检测Fenton反应诱导DNA损伤的电化学DNA传感器研究

利用带正电荷的聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)和带负电荷的小牛胸腺双链DNA(CT-dsDNA)之间的静电吸引作用,将其层层组装到玻碳电极表面,制成电化学DNA传感器,并利用电化学和原子力显微镜(AFM)方法与对DNA的组装进行了表征。以Ru(bpy)23+作为电化学催化剂,检测DNA的损伤,考察了电极在Fenton试剂中的温育时间以及Fenton试剂的浓度对DNA损伤程度的影响。实验表明,Fe2+与H2O2共存时,温育15 min即可较大程度地对DNA造成损伤,且可以检测到的Fenton试剂浓度为5.0×10"5mol/L Fe-SO4/2.0×10"4mol/L H2O2。本方法具有灵敏度高、重现性好等优点。