DNA损伤修复相关通路的合成致死靶点研究及其在卵巢癌中的应用和前景

DNA损伤引发细胞启动一系列DNA损伤应答(DNA damage response,DDR),包括DNA损伤修复、细胞周期检查点激活、细胞周期阻滞、各种细胞内信号转导途径的活化和细胞凋亡等。DNA损伤修复(DNA damage repair)是细胞维持基因组稳定性的重要机制,于2015年获得诺贝尔化学奖。DNA损伤修复途径主要包括:碱基切除修复(base-excision repair,BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)、错配修复(mismatch repair,MMR)、同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)等,分别在DNA单链断裂(single-strand break,SSB)或双链断裂(double-strand break,DSB)等损伤修复中发挥重要作用。DNA损伤修复缺陷与肿瘤发生发展密切相关,同时也是肿瘤治疗的重要靶点。DNA损伤修复通路的多聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase,PARP)与乳腺癌易感基因BRCA 1/2等存在合成致死(synthetic lethality)作用,使PARP抑制剂(PARP inhibitor,PARPi)成为第一个也是目前唯一上市的肿瘤治疗合成致死靶药。PARPi在卵巢癌及多种实体瘤治疗中疗效良好,使DNA损伤修复及相关DDR通路的合成致死靶药研发成为热点,其他在研靶点主要包括:共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia-mutated protein,ATM)、共济失调毛细血管扩张与RAD3相关蛋白(ataxia telangiectasia and Rad3 related protein,ATR)、DNA依赖性蛋白质激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)、细胞周期检测点激酶1(checkpoint kinase1,CHK1)、细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2,CHK2)、阻止有丝分裂的蛋白质激酶WEE1等。PARPi与其他DDR靶药、抗血管生成药物及免疫检查点抑制剂的联用,有可能成为克服PARPi耐药、提高疗效的有效手段和发展前景。本文针对DNA损伤修复及相关DDR通路的关键分子和潜在肿瘤治疗靶点进行综述,阐述了DNA损伤修复相关通路的合成致死靶点研究及在卵巢癌的应用和前景,为基础研究及临床应用提供指导。

DNA损伤应答通路在高钙磷环境诱导的人主动脉血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的 明确DNA损伤应答通路在高钙磷环境诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(HVSMC)钙化过程中的作用。方法 将HVSMC培养分为对照组、模型组、共济失调毛细血管扩张突变激酶(iATM)组、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(iPARP)组,培养12 d。茜素红-S染色法定性和邻-甲酚酞法定量检测4组细胞钙化情况,彗星实验检测DNA损伤,Western blotting和免疫荧光方法检测组蛋白γH2AX磷酸化水平,酶联免疫吸附试验检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHDG)水平,NucleoCounterNC-3000^(TM)高级细胞分析仪分析4组细胞的存活率。结果 光学显微镜和茜素红S染色发现第9天开始,与对照组相比,模型组出现细胞内钙质沉积,第12天钙质沉积明显。对照组与模型组分别在第3、6、9、12天培养状态下Ca^(2+)/蛋白比较,结果:(1)不同时间点Ca^(2+)/蛋白有差异(F=168.970,P=0.000);(2)模型组与对照组Ca^(2+)/蛋白有差异(F=203.040,P=0.000),模型组Ca^(2+)/蛋白较高,钙化明显;(3)两组Ca^(2+)/蛋白变化趋势有差异(F=13.213,P=0.000)。培养12 d时,茜素红S染色发现模型组比对照组钙化程度高,iATM组和iPARP组比模型组钙化程度低。σ-甲酚酞试验发现,iATM组和iPARP组Ca^(2+)/蛋白低于模型组(P <0.05)。彗星试验发现,对照组比较,模型组第9天开始出现更多数量的DNA受损细胞。对照组与模型组分别在第3、6、9、12天培养状态下“彗星细胞”比较,结果:(1)不同时间点“彗星细胞”有差异(F=13.141,P=0.000);(2)模型组与对照组“彗星细胞”有差异(F=121.521,P=0.000),模型组“彗星细胞”百分比较高,DNA损伤明显;(3)模型组与对照组“彗星细胞”变化趋势有差异(F=89.290,P=0.000)。模型组γH2AX蛋白相对表达量高于对照组(P <0.05)。对照组、模型组分别在第3和12天免疫荧光显微镜下观察> 3个γH2AX病灶百分比,结果:(1)不同时间点> 3个γH2AX病灶百分比有差异(F=168.970,P=0.000);(2)模型组与对照组> 3个γH2AX病灶百分比有差异(F=203.040,P=0.000),模型组> 3个γH2AX病灶百分比较高,DNA损伤明显;(3)模型组与对照组> 3个γH2AX病灶百分比变化趋势有差异(F=153.410,P=0.000)。模型组8-OHDG水平高于对照组(P <0.05)。模型组细胞存活率低于对照组、iATM组、iPARP组(P <0.05);iATM组、iPARP组与对照组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 高Ca^(2+)/P环境激活DNA损伤应答信号通路,诱导HVSMC坏死,进而形成钙化。

高钙磷激活DNA损伤应答诱导人主动脉平滑肌细胞早衰

目的探讨DNA损伤应答(DDR)通路调控人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)钙化机制。方法将HASMCs分为对照组、模型组、ATM干预组、PARP干预组,培养12 d。茜素红-S染色法定性和邻-甲酚酞法定量检测细胞钙化;Western blot检测组蛋白γH2AX磷酸化、p16和p21、ATM上Ser1981的磷酸化水平;β-半乳糖苷酶染色检测细胞早衰;qPCR检测p16和p21 mRNA水平。8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHDG)检测氧化应激水平,ELISA方法检测IL-6、IL-8水平。结果模型组较对照组钙化明显,8-OHDG、组蛋白γH2AX磷酸化、β-半乳糖苷酶染色、p16的mRNA和蛋白、p21 mRNA、IL6和IL8、ATM磷酸化等指标有显著变化(P<0.05),ATM和PARP干预组可以缓解模型组的变化。结论高钙磷环境刺激HASMCs产生持续DNA损伤,触发ATM磷酸化并激活p16蛋白表达,诱导细胞早衰导致钙化。

靶向DNA损伤应答在肿瘤放射增敏治疗的研究进展

放射治疗是恶性肿瘤治疗的重要手段,但是,肿瘤放射抗拒是限制放疗疗效、肿瘤复发转移的主要因素。在DNA受损的情况下,细胞内DNA损伤应答随之被激活。研究发现DNA损伤应答不仅影响肿瘤发生,还与肿瘤放射治疗敏感性密切相关,这使其成为肿瘤临床治疗极具前景的靶点。一些针对DNA损伤应答的小分子抑制剂的临床一期实验也正在进行中。本文将对DNA损伤应答在肿瘤中的作用以及DNA损伤应答关键基因和重要路径作为生物标志物和治疗靶点在肿瘤放射增敏治疗中的潜在应用作一综述。

水飞蓟宾对结直肠癌细胞DNA损伤应答的影响

目的探究水飞蓟宾对结直肠癌细胞DNA损伤应答的影响,并探讨其相关分子机制。方法将结直肠癌HCT116和HT29细胞分为空白对照组(DMSO)和水飞蓟宾给药组,给药组按药物浓度分为12.5、25、50、100、200μg/mL 5组。通过倒置显微镜观察给药后各组细胞的生长状态变化;采用CCK-8法检测水飞蓟宾处理后各组细胞的活力变化;采用免疫荧光法(IF)、免疫印迹法(WB)检测水飞蓟宾处理后各组细胞的DNA损伤和细胞周期相关蛋白的表达水平,包括p21、CyclinB1、Phospho-Chk2t68、Aurora A的表达水平;流式细胞术检测细胞周期分布。结果与空白组比较,水飞蓟宾对结直肠癌HCT116和HT29细胞具有明显的生长抑制作用,其抑制率随着给药浓度的增加而增强(P<0.05);与空白对照组相比,水飞蓟宾给药组DNA损伤反应蛋白γ-H2Ax表达明显升高,并且呈药物作用时间和浓度依赖性;细胞周期相关蛋白CyclinB1、Aurora A表达下调,且随着浓度的增加和作用时间的延长逐渐降低,p21、P-Chk2蛋白的表达逐渐上调,随着给药浓度的增加逐渐升高(P<0.05)。结论水飞蓟宾可以抑制结直肠癌HCT116和HT29细胞的增殖、诱导细胞DNA双链断裂损伤、细胞周期阻滞,这些结果提示水飞蓟宾可能通过DNA的损伤应答从而抑制结直肠癌的发生发展。

外泌体与DNA损伤应答的相互调控作用

DNA的完整性和稳定性对于机体的正常运转和生存至关重要,但DNA易受到诸多外源性和内源性因素的影响而造成不同程度的损伤[1]。当DNA发生损伤时,细胞内的特殊分子对损伤的识别将激活DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)系统,通过复杂的信号传导网络募集多种修复因子到损伤部位并启动DNA损伤的修复。

DNA损伤应答中环状GMP-AMP合成酶的UFMylation修饰潜在作用

为探究环状GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthetase,cGAS)翻译后修饰参与DNA损伤应答的潜在作用,转染HeLa细胞和HEK-293T细胞,设置未处理组和Etoposide处理组。基于Western blot和免疫荧光染色,确定HeLa细胞质粒转染效率、Etoposide处理前后的DNA损伤效果、DNA损伤前后cGAS的细胞定位情况。采用免疫共沉淀和Western blot检测HEK-293T细胞cGAS的表达及UFMylation修饰。实验结果显示,HeLa细胞稳定表达cGAS,Etoposide处理可造成明显DNA损伤,未处理组cGAS富集于细胞质,处理组cGAS富集于细胞核。HEK-293T细胞稳定表达转染质粒,同时发现UFMylation修饰的cGAS。因此,cGAS参与DNA损伤应答且可能通过UFMylation修饰调控,为翻译后修饰视角研究DNA损伤应答提供理论参考。

DNA损伤应答机制异常与MDS发生、发展的关系

在生命过程中,生物体的基因组不断受到攻击。识别并修复基因组的损伤对保证生物遗传性状稳定的重要性不言而喻。DNA损伤应答机制异常能够使错误的、甚至是有害的遗传信息在子代细胞中得以表达、并不断扩大,从而促进恶性肿瘤的发生、发展。在包括骨髓增生异常综合征(MDS)在内的血液系统恶性肿瘤中,染色体结构和数量异常比较常见。这些现象提示,在它们的起病和进展过程中,可能像实体肿瘤那样,存在着DNA损伤应答的缺陷,进而导致异常细胞克隆的形成和扩增。在诸多DNA修复机制中,错配修复缺陷的作用比较突出,并且与实体肿瘤的关系比较肯定。但在血液系统肿瘤中进行的类似研究尚未得出公认的结果。

rH2AX与MDC1特异性的结合在DNA损伤应答中的作用

0引言细胞周期检测点非常严格地检测DNA的损伤,并且延迟细胞周期进程而给DNA修复留出时间。如果损伤太剧烈,它们可以触发细胞死亡。越来越多的证据显示DNA检测点内的任何缺陷都可能导致遗传的不稳定性,如肿瘤细胞就是这样产生的。

HPV感染与宿主细胞DNA损伤应答关系的研究进展

人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV),为球形无包膜环状双链DNA病毒,具有高度的嗜上皮特性和种属特异性,能够引起人类皮肤黏膜的增生性病变.HPV感染宿主细胞时,能引起宿主细胞的DNA损伤应答(DNA damage response,DDR).内在或者外界因素引起DNA损伤时,多条信号传导通路被激活,对损伤信号进行监测和传递,并形成一个适当的应答机制,即DDR.多项研究证实,HPV能够利用DDR来完成病毒复制.文章对HPV感染与宿主细胞DNA损伤应答关系的研究进展进行了综述.

病毒感染与宿主细胞DNA损伤应答

病毒感染宿主细胞后,利用细胞内的营养物质和原料进行复制和增殖,同时能引起宿主细胞启动抗病毒免疫应答的防御机制。此外,近年来的研究还表明病毒感染能够引起宿主细胞的DNA损伤应答,该反应是细胞另一种防止病毒入侵的自我保护机制。同时发现,病毒在长期进化过程中形成了不同的机制来对抗宿主细胞的DNA损伤应答,从而消除细胞对其复制和繁殖产生的不利影响。因此,研究和阐述病毒感染后引起宿主细胞DNA损伤应答途径的机制,可使我们采取相应对策选择新的抗病毒靶点,从而有利于新型抗病毒药物的开发。

脆性组氨酸三联体突变体在DNA损伤应答中的作用机制

目的:用建立的稳定表达脆性组氨酸三联体(Fhit)突变体的细胞株,研究Fhit与复制蛋白A(RPA)之间的相互作用对细胞在DNA损伤后的影响。方法:用电离辐射或DNA损伤诱导剂喜树碱处理稳定表达Fhit突变体的阳性细胞株HeLa-FhitA/D/F后,通过流式细胞技术、MTT比色法及克隆形成实验,检测这些细胞系的细胞周期变化情况以及对DNA损伤诱导剂的敏感性。结果:DNA损伤诱导剂处理后,Fhit突变体基因的高表达可以使细胞表现出更强的G2期阻滞及对DNA损伤诱导剂更耐受。结论:Fhit与RPA相互作用的改变影响了细胞对DNA损伤诱导剂的耐受性,为阐明Fhit在维持基因组完整性方面的机理提供了线索。

关于DNA损伤应答的研究进展

DNA损伤应答对保证生物遗传性状稳定具有非常重要的意义。本文对近年来关于DNA损伤应答在细胞周期监测点、基因表达调控、细胞凋亡以及肿瘤等方面的途径进行阐述。

组蛋白泛素化修饰及其在DNA损伤应答中的作用

泛素化修饰是真核生物细胞内重要的翻译后修饰类型,通过调节蛋白质活性、稳定性和亚细胞定位广泛参与细胞内各项信号传导与代谢过程,对维持正常生命活动具有重要意义。组蛋白作为染色质中主要的蛋白成分,与DNA复制转录、修复等行为密切相关,是研究翻译后修饰的热点。DNA损伤后,组蛋白泛素化修饰通过调节核小体结构、激活细胞周期检查点、影响修复因子的招募与装配等诸多途径参与损伤应答。同时,组蛋白泛素化修饰还能调节其他位点翻译后修饰,并通过这种串扰(crosstalk)作用调节DNA损伤应答。本文介绍了组蛋白泛素化修饰的主要位点和相关组分(包括E3连接酶、去泛素化酶与效应分子),以及这些修饰作用共同编译形成的信号网络在DNA损伤应答中的作用,最后总结了目前该领域研究所面临的一些问题,以期为科研人员进一步探索组蛋白密码在DNA损伤应答中的作用提供参考。

参与DNA损伤应答的长链非编码RNA

长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA)曾被看成是转录"噪声",事实上它在多种生命过程中发挥重要作用,其中就包括DNA损伤应答(DNA damage response, DDR)。DDR是细胞维持基因组稳定性的基石,它的缺陷会导致包括癌症在内的多种疾病的发生与发展。近年有关lncRNA在DDR中作用的研究发现,lncRNA不仅参与DDR,而且在DDR多个环节中发挥重要作用。DNA损伤发生后,细胞内许多lncRNA的转录发生显著变化,其中一些lncRNA的转录变化就是DDR调控的结果,如lincRNA-p21等。现有研究显示,这些由DNA损伤胁迫引起转录变化的lncRNA,可以通过调控DDR功能因子转录、参与DDR信号传导和直接参与DNA损伤修复这3种方式参与DDR,另有一些可受激转录的lncRNA则参与维护染色体整倍性和完整的基因组稳定机制,如NORAD和TERRA。

UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进H3K9乙酰化抑制细胞增殖

目的探讨UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中对H3K9乙酰化及细胞增殖的影响。方法体外培养HEK293细胞,构建羟基脲所致的DNA损伤细胞模型;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒,用Western blot评估p CMV-3×Flag-UHRF2转染效率及H3K9乙酰化水平;CCK8法检测HEK293细胞增殖。结果 HEK293细胞经2.5 mmol/L羟基脲处理12 h后,DNA出现了明显的损伤;转染p CMV-3×Flag-UHRF2质粒后,UHRF2蛋白表达显著升高(P<0.01);DNA损伤应答中H3K9乙酰化显著增加(P<0.05);细胞增殖能力明显下降(P<0.05)。结论 UHRF2在羟基脲所致的DNA损伤应答中促进组蛋白H3K9乙酰化抑制细胞增殖。

RCC2在DNA损伤应答及肿瘤中的生物学功能研究进展

RCC2(regulator of chromosome condensation 2),也被称为TD-60(telophase disc protein of 60 kD),是一种高度保守的核蛋白质,结构与RCC1类似。RCC1是Ras相关核蛋白(Ras-related nuclear protein,Ran)的鸟嘌呤交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF),对于细胞周期的正常进行非常重要[1]。类似的,RCC2也主要参与细胞周期的调控;而另一方面,RCC2还可与整合素(integrin)、皮质肌动蛋白(cortactin)等发生相互作用来调节细胞的迁移和细胞分裂[2]。

DNA损伤应答缺陷作为乳腺癌治疗靶点的研究进展

DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)缺陷是近年来乳腺癌治疗研究的热门靶点之一。DDR通路负责DNA损伤后的识别、信号转导和修复,其功能异常可导致细胞的凋亡或基因组不稳定性的增加。目前进入临床研究阶段的乳腺癌DDR靶向药物主要包括多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]抑制剂、ATM抑制剂、CHEK1抑制剂、ATR抑制剂及WEE1抑制剂等。主要从DDR缺陷的概念、以DDR作为靶点的基本原理、DDR各类靶向药物的临床研究现状及其在临床应用中的难点与挑战等方面展开综述。

肿瘤睾丸抗原CT45-5在DNA损伤应答中的作用

目的:用建立的CT45-5-siRNA研究肿瘤睾丸抗原CT45-5在DNA损伤应答中的作用。方法:通过靶向CT45-5基因小干扰RNA(siRNA)下调CT45-5的表达,用MTT比色法检测经喜树碱和依托泊苷处理后细胞对DNA损伤诱导剂的敏感性,用流式细胞技术检测电离辐射后细胞周期的变化。结果:在DNA损伤诱导剂处理后,在脆性组氨酸三联体(Fhit)高表达细胞中下调CT45-5的表达可以使细胞表现出更强的G2期阻滞及对DNA损伤诱导剂更耐受,而在Fhit缺失表达的细胞中却没有此现象。结论:CT45-5可能是以Fhit依赖的途径参与了DNA损伤应答。

脆性X智障蛋白FMRP参与DNA损伤应答的机制

脆性X综合征是世界范围内最常见的遗传性智力缺陷，由脆性x智障蛋白（Fragile X mental retardation protein，FMRP）功能缺陷导致，但其致病机制目前仍然所致甚少。中国科学院遗传与发育生物学研究所张永清研究员研究组和大连医科大学肿瘤干细胞研究院秘晓林教授研究团队密切合作发现FMRP参与调节DNA损伤应答的机制。