氢醌染毒HL-60细胞DNA损伤模型构建及其与DNA-PKCS表达之间的关系

目的探讨DNA-PKCS在氢醌致人急性粒细胞白血病HL-60细胞DNA双链断裂损伤修复中作用。方法采用不同剂量氢醌在不同时间范围内诱导HL-60细胞，应用荧光显微镜检测HQ处理各个阶段γ-H2AX焦点的形成。利用Real Time-PCR、免疫荧光染色等分子生物学技术，研究DNA-PKCS基因在转录和翻译水平的表达。结果染毒后18h组和24h组，50um和100um HQ组γ-H2AX焦点的数目随氢醌浓度的递增而明显增加，但两者相比无明显差异。染毒后18h组和24h组，HL-60细胞内DNA-PKCS转录表达水平与蛋白表达水平诱导氢醌浓度之间存在明显的时间剂量依赖关系。结论50um和100um的氢醌18h和24h处理可以诱导HL-60细胞内明显的DNA双链断裂损伤，且损伤程度与DNA-PKCS表达水平直接相关。

彗星实验方法的优化及影响因素的分析

目的为了更有效地检测细胞DNA损伤,对彗星实验的影响因素进行优化并建立阳性对照。方法以传统碱性彗星实验为基础,对制胶方法、凝胶浓度、琼脂糖溶剂、裂解时间、细胞密度和电泳电压加以优化。以过氧化氢(H_(2)O_(2))作为DNA损伤诱导剂诱导HL-60细胞作为该实验的阳性对照。结果优化后的实验结果显示,制胶方法由三步法进步为两步法,以PBS为琼脂糖溶剂,0.8%正常熔点琼脂糖制备底层胶,0.7%低熔点琼脂糖与细胞悬液混合作为第二层胶,制胶效果好,操作更简单省时,较好地解决了脱胶问题。裂解1 h,1 V/cm电压电泳,获得了具有代表性的彗星图像,结果易于判读,能有效避免假阳性结果。并对不同浓度H_(2)O_(2)诱导的HL-60细胞DNA损伤情况进行比较,成功建立了彗星实验的阳性对照。结论与传统方法相比,优化后的彗星实验方法成本更低,更简单、快速、准确,重复性也更好,能够快速检测细胞中的DNA损伤。