非同位素标记DNA探针和凝胶迁移分析法测定NF-κB激活实验研究

目的:探讨地高辛标记DNA探针和凝胶迁移分析法测定NF-κB激活的优势。方法:用地高辛标记NF-κB基序DNA探针,检测标记效率,探针与核蛋白的结合反应产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜,高温干燥后,与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体杂交,加入CSPD检测化学发光强度。结果:按照上述方法标记DNA探针,标记效率较高。样品核蛋白与地高辛标记的NF-κB基序DNA探针共同孵育,两者相互结合,进行凝胶迁移分析,出现高密度的迁移带。在反应体系中额外加入过量未标记的NF-κB基序DNA探针或抗NF-κB/P65或NF-κB/P50抗体后,抑制了两者的结合,迁移带消失,而加入过量未标记的Oct2A基序DNA探针,不能抑制两者结合,迁移带密度无明显降低,证实了核蛋白NF-κB与DNA探针结合的特异性。结论:本方法无放射性污染,无需特殊设备,操作简便、稳定性好、敏感性强,图像清晰、背景低。