微生物分子生态技术:16S rRNA/DNA方法

综述了以 1 6SrRNA/DNA为基础的分子生物学技术在环境微生物种群分析中的应用 ,目的是使相关的科研人员能够对 1 6SrRNA/DNA技术有一个比较完整的了解 ,并可以开展初步的实验工作。主要内容包括 :DNA指纹技术、 1 6SrDNA文库的建立、DNA测序及微生物分类鉴定 (即系统发育树分析 )、基因探针设计和测试。

动物物种鉴定的非DNA方法评述

为了规范管理涉及动物的经济活动,打击违法犯罪行为,保护野生动物资源,在规范管理和保护执法的过程中,必然要对涉及到的动物进行物种鉴定.文中介绍了动物物种鉴定常用的形态鉴定法、显微镜镜检法、理化检验法、蛋白质分析法和免疫学鉴定法等5种非DNA方法及其在实践中的使用概况,并分别对每种方法在鉴定中的应用进行了评价.在此基础上认为一类方法解决所有动物物种鉴定问题是不可能的,最后提出鉴定方法的方便、快捷,鉴定成本的低廉,多学科的交叉以及与计算机技术的联合是动物物种鉴定的发展方向.

向植物导入外源DNA方法的研究与发展

为满足人类对粮食和其它农产品的多种需求,利用现代生物技术手段培育高产,稳产、优质、抗病虫,抗逆植物新品种是农业生物技术研究的主要内容之一。对植物进行遗传改造的首要环节是,研究和开发向植物细胞导入外源基因的技术。近年来,向植物细胞导入外源DNA的方法在实践中不断创新发展。目前主要采用的方法有以下几种: 一、根癌土壤杆菌介导的外源基因转移 整合型的根癌土壤杆菌Ti质粒是最常用的一种载体。研究最多的是octopine(章鱼碱)型和nopaline(胭脂碱)型Ti质粒。在Ti质粒上有一段T-区,T-DNA能从该质粒转移到敏感植物的核基因组中。T-DNA边界有25bp正向重复序列可能接受某种酶识别切割,进而形成环状中间体。此外,Ti质粒上还有—个约50kb的Virulence区(简称Vir区),约有十几个基因。Vir区不在T-DNA内。

一种高通量提取桃DNA方法的建立与应用

【目的】DNA制备是大规模基因型筛选和分子标记辅助选种的重要前提,本研究采用一种1.2 m L八联排管代替单个离心管,探索一种操作简便、节约时间、成本低的桃DNA快速提取方法,以满足高通量遗传研究的需求,提高工作效率。【方法】以普通生长型桃(standard type,ST)‘中油桃8号’为母本,温度敏感半矮生型桃(temperature-sensitive semi-dwarf in Prunus persica,Pp Tssd)‘09-1-112’为父本,杂交获得F1代分离群体500株实生苗为载体,包括温度敏感半矮生型246株,普通生长型254株,建立一种高通量、低成本桃DNA提取方法。利用1.2 m L八联排管结合八通道移液器,简化提取步骤,提取桃幼嫩叶片中的基因组DNA;通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA浓度、纯度和完整性进行检测。基于高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM),采用96孔板对温度敏感半矮生型桃和普通生长型桃共500个F1分离后代单株进行PCR扩增和基因分型,区分TSSDtssd基因型与tssdtssd基因型。基于双亲表型与基因型一致,开发In Del位点,PCR扩增后,采用SDS-PAGE在F1群体中进行验证,确定利用分离的DNA是否正确区分不同基因型。【结果】分离的DNA经紫外分光光度计检测,浓度范围约为25—200 ng·μL-1,OD260nm/OD280nm约为1.81—1.98,DNA纯度较高;琼脂糖凝胶电泳条带清晰、单一,DNA完整度较高。参考桃基因组(Version 2.0),根据双亲深度测序数据,开发获得SNP标记SNP_Pp03_3758620,应用于高分辨率熔解曲线基因分型,发现温度敏感半矮生型和普通生长型呈现明显不同的峰型,证明提取的DNA模板可应用于HRM基因分型。基于双亲基因型与表型一致,开发In Del标记In Del_Pp03_3829009,聚丙烯酰胺凝胶电泳的验证结果显示PCR扩增具有较高的强度,获得与目的片段大小一致的特异性条带,且在两种不同生长型单株中具有明显的多态性,表明PCR扩增稳定,提取的DNA可用于基于In Del标记的多态性分析。使用该提取方法,每人每天可以完成1 000个样品的DNA提取,成本较低,且不会对幼苗早期生长造成影响。【结论】建立了一种简便、有效、低成本的桃基因组DNA提取方法,可以满足基因分型、品种鉴定及遗传分析等分子生物学研究,实现了大批量不同样本基因组DNA的同时提取,具有较高应用价值。

提取线粒体DNA方法的比较及较纯线粒体基因获取方法的确立

目的:对2种常用的线粒体DNA提取方法进行比较,分析提取物中核DNA的存在情况,同时建立新检测方法降低线粒体假基因干扰。方法:以仅在核DNA中存在的基因β-actin作为核DNA存在的标定基因,通过PCR方法扩增线粒体DNA上的一段基因MTND5-2,并以β-actin做参比,比较常用的2种提取线粒体DNA方法的优劣,即碱法Ⅰ(先提取完整线粒体后从中获得线粒体DNA)和碱法Ⅱ(根据线粒体DNA与核DNA的结构差异,从中获得双链环状的线粒体DNA)。结果:2种线粒体DNA提取方法并不能获得仅含线粒体DNA的纯提取物,碱法Ⅰ获得的线粒体DNA纯度相对较高;以碱法Ⅰ提取物为模板进行PCR,可获得更多较纯的线粒体目的基因。结论:碱法Ⅰ较碱法Ⅱ可获得更纯的线粒体来源的目的基因;新建方法可获得较纯的线粒体基因,且是一种简单、方便、经济的方法。

自动化工作站批量提取烤后烟叶DNA方法的建立与应用

为建立高效、快速、准确的烤后烟叶DNA提取方法,采用BioMek NXP自动化工作站与国产DNA磁珠法提取试剂盒相结合,建立了自动化批量提取烤后烟叶基因组DNA（作为PCR模板）的方法,以获取高质量的烤后烟叶DNA满足PCR检测需求。结果表明：水浴时间30min、样本量70-80mg、80%乙醇洗涤4次能获得OD260/OD280为1.7-1.9,浓度大于100ng/μL的烤后烟叶基因组DNA,合格率达95.8%。经PCR定性扩增烟草硝酸还原酶基因（NR）,该方法所提的DNA溶液中无PCR反应抑制物残留,可直接用于PCR定性分析。烟叶粉末经预处理,取上清液上机后约110min可完成96份样品的DNA提取工作。

新的环境DNA方法可用于监测水生生物多样性

来自英国东安格利亚大学（UEA）的一组科学家开创了一种新的DNA分析方法，以帮助监测英国水域的生物多样性，保护濒危物种。

不同DNA提取方法对大曲基因组DNA提取效果及扩增子文库的影响

大曲是中国传统白酒典型的“多酶多菌”的发酵剂。免培养的分子生物学方法已经成为大曲微生物群落研究的常规方法。通过评估不同DNA提取方法对大曲基因组DNA提取效果及扩增子文库的影响,选择适合用于大曲DNA提取的最佳方法。该研究选择4种DNA提取方法分别对2种大曲进行大曲微生物DNA的提取,结合DNA提取质量、qPCR定量结果、细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因扩增子文库的Illumina Miseq测序结果,评估大曲基因组DNA不同提取方法的效果。从DNA得率和生物量的综合分析表明,SDS-based提取法的DNA得率高于试剂盒提取法,其中原位SDS-based提取法DNA得率高达5.46×10^(4)ng/g,但DNA纯度较低;SDS-based提取法的qPCR定量结果比试剂盒提取法高10^(1)~10^(6)量级,其中洗脱加SDS-based提取法的微生物生物量最高,比原位SDS-based提取法的生物量高10^(1)~10^(3)量级;试剂盒提取法的微生物生物量最低,细菌和真菌的生物量只有10^(2)~10^(4)copies/g。扩增子文库间Shannon多样性指数的比较结果表明,不同DNA提取方法在真菌ITS扩增子文库间存在显著差异,而在细菌16S rDNA扩增子文库间差异不显著。洗脱处理样本的真菌扩增子文库Shannon指数要高于原位处理的样本。通过对扩增子文库间存在显著性差异操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)的比较可以看出,在细菌16S rDNA扩增子文库中,多数OTUs存在丰度差异,但它们大多数能在不同DNA提取方法中检测到;然而在真菌ITS扩增子文库间,少数OTUs在不同DNA提取方法中检测不到,说明DNA提取方法对部分真菌微生物基因组的提取存在显著影响,且洗脱处理有利于真菌基因组DNA的提取。综合对比4种DNA提取方法,洗脱加SDS-based提取法最适合用于大曲微生物的定量和群落结构分析。

入侵植物一年蓬基因组DNA提取方法优化

一年蓬为菊科飞蓬属植物,是分布较广、危害较重的一种外来入侵杂草。为优选该植物基因组DNA的提取方法,本研究采取四因素三水平正交试验设计,对一年蓬基因组DNA的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取方法进行优化,并与常规的植物基因组试剂盒法进行对比。结果表明,一年蓬基因组DNA较优的提取方法为改良CTAB法,即一年蓬的干燥叶片经CTAB-free去除多糖,并加入β-巯基乙醇防止酚氧化,用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提3次。改良CTAB法提取的一年蓬基因组DNA质量较高,微量分光光度计检测的A_(260)/A_(280)数值接近1.8~2.0,且凝胶电泳DNA条带清晰,无明显拖带。该方法为该植物的遗传多样性和入侵机制等研究提供参考。

石斛基因组DNA提取方法比较研究

目的:比较3种基因组DNA提取试剂盒对提取富含多糖多酚类物质的铁皮石斛和霍山石斛鲜叶及冻叶的提取效果。方法:对提取的DNA进行纯度及产率检测、电泳质量分析及ITS2 PCR扩增效率检测。结果:市售基于蛋白酶K消化法的试剂盒不适用于石斛DNA提取;基于改良CTAB法的试剂盒更适用于需要较高DNA模板量的石斛鲜叶的DNA提取;基于改良SDS法的试剂盒更适用于石斛冻叶的DNA提取,该法提取的鲜叶DNA完整性最佳,更适用于对DNA完整度要求较高的DNA大片段的分析研究。结论:基于改良CTAB法和改良SDS法的试剂盒提取的石斛鲜叶及冻叶的基因组DNA均适用于常规分子检测。

一种高效的树木总DNA提取方法

高质量的DNA是林木分子生物学研究的关键因素之一。在高浓度离液剂异硫氰酸胍(GuSCN)存在的条件下,核酸具有与硅珠(SiO2)颗粒结合、并能在较高温度下被低盐浓度溶液洗脱的特性。基于这一原理建立了一种新的树木叶片总DNA提取方法。此方法操作简单、快速,经过浓度、纯度测定,以及PCR扩增和限制性内切酶消化证明,从不同树木叶片中均得到了高质量的DNA样品。

普通甲醛固定石蜡包埋组织DNA提取方法的探讨

背景与目的:在国内,几乎所有的医院和科研机构均应用普通甲醛固定手术标本,但因为普通甲醛固定石蜡包埋组织中的DNA降解相对严重,从这些蜡块中提取高质量的DNA非常困难。本研究的目的是寻找从普通甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的理想方法。方法:取我院2000年甲醛固定石蜡包埋的手术切除食管癌标本15例,分别以蛋白酶K消化和不同pH值下加热两种裂解方法裂解细胞,以酚氯仿抽提法提取其DNA;并在蛋白酶K消化法进行DNA提取的过程中,应用交叉设计对二戊烯或二甲苯脱蜡、37℃或56℃消化48h或72h、氯化钠盐析或酚氯仿抽提4种参数进行研究,所得DNA质量以电泳分析和PCR扩增结果判断。结果:蛋白酶K消化酚氯仿抽提法所得DNA产量(平均值为17.88μg)和质量均高于pH值为7～12条件下的加热提取法(P<0.05)。56℃消化所得的DNA质量明显优于37℃,而消化72h的DNA亦明显优于48h者。不同脱蜡方法和抽提方法对DNA的产量和质量影响不大,结论:以蛋白酶K消化氯化钠盐析法,从普通甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA质量较可靠。并且,应用蛋白酶K于56℃消化3天更能获得高质量和高产量的DNA。

漾濞核桃叶片基因组DNA的两种提取方法效果比较

以漾濞核桃不同生长期的叶片为材料,采用高盐低pH法和改良CTAB法作提取其基因组DNA的效果比较实验。通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计和RAPD扩增对所提取的DNA样品进行检测,比较所得DNA的产量、质量,认为从漾濞核桃不同发育时期叶片中获得DNA的提取效果不同。4种叶样以冬芽和新叶的效果为好,老叶最差;用两种提取方法从叶片中得到的DNA产量和质量有所不同,高盐低pH法提取的DNA纯度高,但是产量较低;而改良CTAB法则相反,产量高,纯度低。

适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法的研究

目的建立适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法。方法以6种富含次生代谢物质的药用顽拗植物为材料,对7种DNA提取方法进行比较。结果CTAB法3对中药材具有通用性,操作简便、快速,提取的DNA浓度和合格率比其他对照方法高,能满足DNA条形码PCR扩增的要求。该方法主要特点:(1)用3%的CTAB浓度代替常用的2%CTAB;(2)采用1%的PVP与0.2%β-巯基乙醇共同去除杂质和防止DNA降解;(3)采用10000r/min离心15min去除蛋白质等杂质。结论CTAB法3是适合中药材DNA条形码研究的DNA提取方法。

梨不同DNA提取方法的效果研究

以 7个梨品种为实验材料 ,比较分析了SDS法、CTAB法、SDS CTAB法、改良的CTAB法、高盐低pH值法、分步离心法对梨总DNA提取的效果。结果表明 :利用以上 6种方法提取的梨总DNA在纯度和量上有很大的差别。所得到的平均DNA量从大到小依次为 :分步离心法、SDS法、SDS CTAB法、改良的CTAB法、CTAB法、高盐低pH值法。DNA提取纯度依次为分步离心法、SDS CTAB法、改良的CTAB法、高盐低pH值法、CTAB法、SDS法。RAPD和自交不亲和基因 (S基因 )特异性引物扩增实验结果都比较理想 ,但分步离心法和SDS CTAB法提取的DNA双酶切效果较好。分步离心法提取的梨总DNA更适用于后续的分子生物学实验操作。

一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法

报道了一种简易的拟南芥幼苗微量DNA提取方法。该方法可在常温下进行DNA提取,而且样品用量少,仅需10mg左右,用100μL重蒸水回溶DNA沉淀所获得的粗提液可直接用于PCR检测。结果表明:应用该法提取的DNA完整性好,PCR效果佳,适用于拟南芥转基因植株鉴定。

美花石斛基因组DNA提取方法的比较

采用CTAB法、尿素法、高盐低pH法、SDS法和陈大明法等5种方法提取美花石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe)基因组总DNA,通过电泳、紫外光谱分析和RAPD-PCR扩增等检测手段,比较分析了DNA质量。DNA条带显示改良CTAB法和改良尿素法较好。