结核分枝杆菌DNA旋转酶B抑制剂的研究进展

DNA旋转酶是抗结核药物的一个新的靶点,其是由两个A亚基和两个B亚基组成的异源四聚体(A2B2)。A亚基含有DNA断裂重聚位点,而B亚基则参与ATP的水解过程,为A亚基提供能量以维持DNA的拓扑状态。因此,针对DNA旋转酶的抑制剂主要分为两类:第一种类型的抑制剂靶向DNA旋转酶A亚基,抑制DNA断裂重聚功能,其中代表药物为氟喹诺酮类药物。第二种类型的抑制剂靶向DNA旋转酶B亚基的ATP结构域并阻断ATP水解。由于第一种类型抑制剂氟喹诺酮类药物已经产生了严重的耐药性。因此,第二种类型的抑制剂成为了当前开发新的强效抗结核药物的研究热点。本文主要对近5年以来结核分枝杆菌DNA旋转酶B抑制剂的最新研究进展进行了综述,同时简要介绍结核分枝杆菌DNA旋转酶B的相关内容。

禽大肠杆菌DNA旋转酶活性改变与其对氟喹诺酮类药物耐药性的关系研究

用亚ＭＩＣ（药物最低抑菌浓度）连续递增式传代培养法获得了禽大肠杆菌（血清型为Ｏ１、Ｏ２、Ｏ７８）对氟喹诺酮类药物（ＦＱｓ）—诺氟沙星（ＮＦＬＸ）、依诺沙星（ＥＮＸ）、环丙沙星（ＣＰＬＸ）稳定的高度耐药菌株（ＭＩＣ提高≥１２８倍），通过对耐药菌株和敏感菌株ＤＮＡ旋转酶的分离、提取及活性检测，并进行统计学分析比较，研究ＤＮＡ旋转酶活性改变与细菌耐药的关系，结果表明：禽大肠杆菌对氟喹诺酮类药物产生耐药的一个重要因素为其ＤＮＡ旋转酶的活性改变。

鸡源性沙门氏菌DNA旋转酶与耐氟喹诺酮类药物关系研究

取临床分离的、对5种氟喹诺酮类药物(环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星和沙拉沙星)均耐药的9株鸡源性沙门氏菌耐药株,提取其染色体DNA。设计引物gyrAF和gyrAR、gyrBF和gyrBR,分别扩增菌株DNA旋转酶gyrA基因和gyrB基因的氟喹诺酮类耐药决定区(QRDR),对PCR扩增产物进行测序及序列分析。与质控菌株相比,9株临床分离耐药株中只有菌株38和60的gyrA基因发生单碱基突变,菌株38的gyrA基因第371位碱基发生C→T突变,菌株60的gyrA基因第350位碱基发生A→C突变,两处突变均位于QRDR内,其余菌株的核苷酸未发生任何突变。菌株38的碱基突变导致gyrA基因第99位氨基酸发生R→C取代,即Arg→Cys;菌株60的碱基突变导致gyrA基因第92位氨基酸发生M→L取代,即Met→Leu。9株临床分离鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株gyrB基因QRDR的核苷酸序列与质控菌株完全相同;只有菌株42的gyrB基因第1592位碱基发生C→A突变,但其位于gyrB基因QRDR之外,且菌株42的gyrB基因的碱基突变并没有导致相应氨基酸的改变。上述结果提示,DNA旋转酶gyrA基因和gyrB基因QRDR突变可能并非沙门氏菌耐药性产生的主要原因。

聚合酶链反应RFLP与SSCP检测伤寒杆菌DNA旋转酶基因变异

DNA旋转酶为喹诺酮类抗菌药物作用靶位 ,其变异为细菌耐药主要原因之一。本文利用 PCR-RFL P、SSCP对伤寒杆菌 2 75 (临床分离敏感株 )及其自发耐药突变株 RG1 DNA旋转酶 A亚单位基因 (gyr A)耐喹诺酮类决定区进行检测 ,并以 DNA序列分析对该变异进行检测。结果表明 ,与伤寒杆菌 2 75相比 ,RG1 gyr A第 2 47位由 T变异为 G,相应于 DNA旋转酶 A亚单位第 83位氨酸由丝氨酸变为丙氨酸。Hinf 对PCR产物酶切分析表明有一 GANTC序列变异 ,SSCP则发现伤寒杆菌 2 75与 RG1 DNA电泳图象有明确差异。结果表明 PCR- RFL P、SSCP检测伤寒杆菌 gyr A变异快速、特异和灵敏。

DNA旋转酶与细菌对喹诺酮类药物的耐药性

近年来,喹诺酮类药物的开发与应用引人注目,这些药物包括氟哌酸、氟嗪酸、环丙氟哌酸、多氟哌酸(Fleroxacin)等,其中多数品种从早期的萘啶酸和奥索利酸衍生而来,其抗菌作用比老品种更强,抗菌谱更广。但临床应用后不久。

革兰氏阳性菌DNA旋转酶提取方法

近年来,喹诺酮类药物已成为临床上常用的抗菌药物之一。但应用不久后细菌耐药性较快产生,不仅影响临床疗效,而且阻碍扩大应用的可能。现已明确细菌DNA旋转酶是耐药的重要因素。其分子是一个4叠体,由两个A和两个B亚单位组成。A、B亚单位只有重组后才表现出酶活性,ATP。

伤寒沙门菌DNA旋转酶A亚单位基因(gyrA)序列分析

本文利用伤寒沙门菌２７５（临床敏感菌株）及其耐喹诺酮类自发变异株ＲＧ１，测定其ＤＮＡ旋转酶Ａ业单位基因（ｇｙｒＡ）喹诺酮类耐药决定区（ＱＲＤＲ）碱基序列，分析药物与细菌相互作用关系。结果发现伤寒沙门菌２７５ ｇｙｒＡ第１２８－４３４位碱基与大肠埃希菌ＫＬ－１６、鼠伤寒沙门菌ＮＣＴＣ ７４及铜绿假单胞菌ＰＡＯＩ相应碱基有９２．５１％、９７．２２％及７７．３５％同源性，推定氨基酸仅有３、 ２及１３处变异；伤寒沙菌ＲＧＩ ｇｙｒＡ仅于第２４７位碱基由Ｔ→ Ｇ％异，相应第８３位氨基酸由Ｓｅｒ→Ａｌａ改变，使药物与ＤＮＡ旋转酶亲合力降低，萘啶酸、氧氟沙星、环丙沙星对伤寒沙门菌ＲＧＩ的ＭＩＣ值较对伤寒沙门菌２７５增加３２倍以上。上述结果提示喹诺酮类抗伤寒沙门菌机制与其它细菌相同，ｇｙｒＡ ＱＲＤＲ变异是伤寒沙门菌耐药的主要原因。

具有全新机理的DNA旋转酶抑制剂的筛选及抑菌活性

利用具有新机制的抗耐药菌DNA旋转酶抑制剂GSK299423与DNA旋转酶的晶体复合物(PDB code:2XCS)构建基于配体-受体复合物的药效团模型,诱骗集(Decoy set)验证结果表明该药效团模型具有较强的活性识别能力.将药效团模型与分子对接相结合用于筛选化合物库,通过抑菌活性测定,获得了具有抗多药耐药菌活性的DNA旋转酶抑制剂LTH02.

肺炎克雷伯氏菌DNA旋转酶分离及喹诺酮类药物对其抑制作用

应用溶菌酶溶菌、硫酸铵沉淀蛋白质及新生霉素琼脂糖ＣＬ－６８亲合层析相结合的方法，成功地从肺炎克雷伯氏菌９００１２９分离到ＤＮＡ旋转酶的Ａ、Ｂ亚单位。单独的Ａ、Ｂ亚单位均无ＤＮＡ旋转酶活性，以Ａ、Ｂ亚单位重建的酶能将松弛的质粒（ｐＢＲ３２２）ＤＮＡ转变为超旋型。各种喹诺酮类药物对其活性具有抑制作用。萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、斯巴沙星、环丙沙星对该酶活性５０％抑制浓度（１Ｃ＿（５０））分别为１０．４６、１．３５、０．３５、０．４２和０．１２μｇ／ｍｌ。各药物１Ｃ＿（５０）与其最低抑菌浓度（Ｍ１Ｃ）相平行。

伤寒沙门菌DNA旋转酶gyrA及拓扑异构酶Ⅳ parC基因与耐喹诺酮类关系研究

目的 研究DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ在伤寒沙门菌耐喹诺酮类药物的作用。方法对临床分离喹诺酮类敏感伤寒沙门菌 2 75及其自发耐药变异菌RG1 的gyrA、parC基因喹诺酮类耐性决定区进行PCRDNA直接测序分析。结果 表明伤寒沙门菌 2 75gyrA、parC与大肠埃希菌相应DNA序列分别有 92 5 1%与 97 0 1%同源性 ,推定氨基酸序列仅有 3与 6个的差异。伤寒沙门菌gyrA及parC也有较好同源性 ,相应区段氨基酸有 6 0 92 %相同。伤寒沙门菌RG1 与 2 75相比 ,gyrA第 2 47位T→G变异 ,致Ser 83Ala氨基酸替换 ,两者parC完全相同。喹诺酮类药物对RG1 MIC较对伤寒沙门菌2 75上升 32倍或以上。结论 DNA旋转酶、拓扑异构酶Ⅳ为喹诺酮类药物作用靶位 ,但以DNA旋转酶为主 ,该酶变异为伤寒沙门菌耐药的主要原因。

达氟沙星在水产养殖中的研究进展

达氟沙星(Danofloxacin)属于第三代动物专用氟喹诺酮类抗菌药物,临床常用甲磺酸达氟沙星。该药作用于细菌的DNA旋转酶亚单位,抑制细菌DNA复制及转录,进而产生杀菌作用。其抗菌谱广,对大肠埃希菌(Escherichia coli)、沙门菌(Salmonella)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae)、变形杆菌(Proteus sp.)。

成都地区拓扑异构酶基因突变在解脲脲原体对氟喹诺酮类药物耐药中的作用

目的探讨拓扑异构酶基因gyrA、gyrB、parC和parE突变与解脲脲原体对氟喹诺酮类药物耐药的关系,提供本地区耐药解脲脲原体的流行病学资料。方法联合固体培养法和16SrRNA基因测序技术对解脲脲原体进行鉴定,采用微量肉汤稀释法进行最低抑菌浓度的测定。基因扩增采用聚合酶链反应,测序结果用DNAMAN软件和BLAST进行分析。结果2021年9月—2022年2月本院区微生物实验室共收到支原体培养标本1387例,其中解脲脲原体单独阳性感染的有635例,解脲脲原体阳性率为45.78%(635/1387)。随机选取58株解脲脲原体阳性菌株进行微量肉汤稀释法药敏试验和拓扑异构酶基因QRDR区的扩增测序,解脲脲原体对左氧氟沙星和莫西沙星的耐药率分别为79.31%(46/58)和5.17%(3/58)。ParC S83L、ParC T125A和GyrB P462S的变异率分别占79.31%(46/58)、15.52%(9/58)和5.17%(3/58)。所有菌株的gyrA和parE基因未发现突变位点。结论拓扑异构酶基因parC 248位碱基C突变为T导致的ParC S83L变异为解脲脲原体对氟喹诺酮类药物耐药的主要机制,parC和gyrB基因的双突变可导致耐药性的进一步增加。

发现大肠埃希菌喹诺酮耐药株gyrA基因新亚型和aac(6′)-Ⅰb-Cr、mdfA基因

目的了解大肠埃希菌(E.coli)对常用抗菌药物的耐药性及喹诺酮类DNA旋转酶基因、多药外排基因及氨基糖苷类修饰酶基因(AMEs)的存在情况。方法收集2006年1月～2008年10月本院临床标本分离的E.coli 60株,用K-B法检测细菌对16种抗菌药物的敏感性,用PCR及测序技术分析6种喹诺酮类基因(gyrA、qnrA、qnrB、qnrS、qepA、mdfA)和1种AMEs基因aac(6′)-Ⅰb。结果 60株菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均为78.4%(47/60);55株菌存在gyrA基因突变,其中3株菌gyrA与美国NCB I中已登录的gyrA基因序列不同,为新亚型;mdfA基因均阳性;对9株aac(6′)-Ⅰb基因PCR阳性产物进行测序,证实5株携带aac(6′)-Ⅰb-Cr双功能酶基因。结论 gyrA基因突变是E.coli对喹诺酮类药物最主要的耐药机制,耐喹诺酮类药物的E.coli株中发现aac(6′)-Ⅰb-Cr基因和gyrA新亚型,E.coli检出mdfA基因为中国大陆地区首次报道。

伤寒杆菌耐喹诺酮类机理研究

以伤寒杆菌临床分离的喹诺酮类敏感株 S2 75与其诱导耐药株 RG1 与 RG2 ,对有关伤寒杆菌耐喹诺酮类机制进行了研究。结果发现与伤寒杆菌 S2 75相比较 ,RG1 与 RG2 对喹诺酮类、四环素、氯霉素敏感性明显降低 ,对头孢唑林 ,亚胺培南敏感性有所增加。喹诺酮类对 DNA旋转酶活性 5 0 %抑制剂量 ,RG1 与RG2 较 S2 75呈 3～ 8倍增加 ,S2 75与 RG1 、RG2 旋转酶亚单位交叉重建及 DNA旋转酶 A亚单位基因 (gyr A)喹诺酮耐药决定区 PCR- RFL P分析表明 A亚单位变异为耐药原因之一。细菌对氧氟沙星聚积测定 ,RG1 与RG2 分别为 S2 75之 1/ 2与 1/ 8,经 CCCP处理后 ,分别上升为 S2 75原水平与 S2 75之 1/ 2水平。外膜蛋白分析示 RG2 5 5 k D蛋白带消失 ,同时伴生化反应改变。表明伤寒杆菌耐喹诺酮类机制存在 DNA旋转酶变异 ,药物主动外运及外膜通透性改变。

志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药

目的探讨DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因突变与志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性。方法用聚合酶链反应(PCR)检测志贺菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关gyrA、parC基因并挑选11株菌扩增片段进行DNA测序,分析突变位点与药敏结果的关系。结果11株扩增片段测序结果显示,9株耐萘啶酸菌均在gyrA 83位发生有意义突变TCG(Ser)→TTG(Leu),宋内志贺菌未发生parC基因突变,5株耐萘啶酸、诺氟沙星和/或环丙沙星中介敏感福氏志贺菌在parC 80位发生有意义突变AGC(Ser)→ATC(Ile)。结论志贺菌对喹诺酮类药物耐药严重,福氏志贺菌比宋内志贺菌更耐此类药物,靶酶基因突变是其耐喹诺酮类药物的主要机制之一,gyrA Ser83→Leu突变是导致志贺菌临床株对萘啶酸耐药的关键突变。parC基因突变在gyrA基因突变的基础上才会发生,parC突变可能引起诺氟沙星和/或环丙沙星不敏感。

宋内志贺菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性研究

目的检测宋内志贺菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药情况,探讨染色体介导DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因突变或(和)质粒介导qnrA基因存在与宋内志贺菌耐喹诺酮类药物的相关性。方法用K-B纸片扩散法对58株宋内志贺菌进行耐药性检测;PCR法检测宋内志贺菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)相关gyrA、parC基因,并根据药敏结果挑选5株菌扩增片段进行DNA测序;PCR法扩增qnrA基因片段。分析宋内志贺菌gyrA、parC基因突变或(和)qnrA基因存在与喹诺酮类药物耐药性的关系。结果宋内志贺菌对萘啶酸的耐药率高达94.8%。58株宋内志贺菌中,8株检出qnrA基因,5株测序gyrA、parC基因的菌株中,4株萘啶酸耐药菌株均在gyrA83位发生有义突变TCG(Ser)→TTG(Leu),但未发生parC基因突变,gyrA基因突变菌株对萘啶酸全耐药。qnrA基因阳性菌株对5种喹诺酮类药物抑菌圈中位数比较都缩小;对NAL、氧氟沙星的耐药率高于qnrA基因阴性菌株(P<0.05),差异有统计学意义。结论gyrASer83→Leu突变是导致宋内志贺菌临床分离株对喹诺酮类药物耐药的关键突变,宋内志贺菌若携带质粒介导qnrA基因则会导致对喹诺酮类药物的敏感性下降,若两者同存也可引起喹诺酮类药物耐药增强,除萘啶酸耐药外对其他喹诺酮类药物也可呈中介。

体外氟喹诺酮类诱导肺炎克雷伯菌耐药与临床分离耐药株QRDR变异的差异研究

目的比较体外氟喹诺酮类诱导的肺炎克雷伯菌耐药株和临床分离耐药株的DNA旋转酶A亚单位(gyrA)基因上的喹诺酮类耐药决定区域(QRDR)变异的差异与其耐药性的关系。方法对10株敏感肺炎克雷伯菌经环丙沙星诱导出耐药菌,对其gyrAQRDR进行聚合酶链反应(PCR)扩增和DNA序列的分析比较,并与临床分离耐药株比较。结果发现诱导耐药菌存在着gyrA的QRDR变异,同氟喹诺酮类耐药性相关的变异有Ser83(TCC)→Phe(TTC)、Ile(ATC);Gln106(CAG)→Leu(CTG);其中Gln106(CAG)→Leu(CTG)的变异是本研究的新发现。结论诱导耐药菌存在着gyrA的QRDR变异,其中Ser 83(TCC)和Gln106(CAG)的变异可能是诱导耐药菌耐药的分子基础。