原位DNA杂交法对活组织标本沙眼衣原体的诊断

在美国由性传播沙眼衣原体病极为普遍,引起的综合病症很多,包括男性非淋球菌性尿道炎、附睾炎;女性子宫颈炎,子宫内膜炎和输卵管炎;肝周围炎,阑尾炎和结膜炎,男女性病性淋巴肉芽肿 LGV。带菌的母亲可使其婴儿感染上结膜炎或肺炎。另外,非性病淋巴肉芽肿和性病淋巴肉芽肿的血清型菌株均能引起炎性直肠炎,某些患者由 LGV 血清型菌株引起的严重淋巴肉芽肿直肠炎在组织病理学和临床特征上很难与节段性直肠炎区别开来,因此诊断也很困难。

荧光法和DNA杂交法检测重组技术产品中残余DNA的比较

目的:对用于检测重组技术产品中残余DNA的荧光法及DNA杂交法进行比较性评价。方法:应用地高辛标记的DNA杂交法以及PicoGreen荧光法对3批重组人干扰素α2b中外源DNA残留量进行测定。结果:荧光法检测结果显示3批重组人干扰素α2b制品中DNA残留量分别为每人份剂量(0.695±0.021)ng、(0.664±0.021)ng、(0.916±0.017)ng,而用地高辛标记的DNA杂交实验由于阳性基因组DNA灵敏度偏低以至于结果无法判断。应用琼脂糖凝胶电泳和PicoGreen荧光法测得由生产单位提供的阳性DNA浓度明显偏低,与标示量不符,这说明阳性DNA含量偏低是本次DNA杂交实验失败的主要原因。通过对该阳性DNA重新定量后再进行DNA杂交检测,结果显示3批重组人干扰素α2b制品的DNA残留量均小于每人份剂量1ng,该结果与PicoGreen荧光法相一致。结论:荧光法具有简便、快速,自动化程度高,不受工程菌种类限制,能够精确定量等特点,优于传统的DNA杂交法,更适于重组制品残余外源DNA含量的常规检定。

宫颈癌筛查方法及其新进展

宫颈癌是威胁女性最主要的恶性肿瘤之一,近年来发病率不断上升,尤其是年轻化趋势现象(≤35岁)的出现引起了广大研究者的关注,而早期宫颈癌的治疗效果和5年生存率也位于恶性肿瘤的前列,这一特点使宫颈癌的筛查具有了非凡的意义。自多种筛查方法应用于临床以来,宫颈癌的发病率和死亡率都有显著改善。除传统的宫颈涂片细胞学检查以外,目前宫颈癌的筛查方法主要有:薄层液基细胞学检查、阴道镜检查、HPV-DNA检查和肉眼观察等。根据不同地区的经济条件和人群特征,这些筛查方式单独或联合使用对宫颈癌及癌前病变的检出均具有很大的临床意义。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留定量PCR检测法的验证

目的验证Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留定量PCR(quantitative PCR,qPCR)检测法。方法用试剂盒提取Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液的DNA,采用qPCR检测Vero细胞DNA,并验证方法的线性、专属性、准确性、精密度、耐用性及定量限;同时采用DNA探针杂交法检测样品。结果qPCR检测Vero细胞DNA标准曲线在0.0030~300.0000pg/μl之间线性良好;对Hep-2细胞、大肠埃希菌、酵母细胞DNA均无扩增反应;高、中、低浓度样品加标回收率在50%~150%,准确性良好;定量检出限为0.0030pg/μl;精密度良好(相对标准偏差<15%);反应体系配制好后置于2~8℃30min后进行检测,相对标准偏差<15%,耐用性良好。DNA探针杂交法与qPCR结果均小于0.1pg/μl。结论qPCR检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留具有良好的线性、专属性、准确性、精密度和耐用性,可适用于该项检测。

特立帕肽宿主DNA残留量检测方法研究

目的:对特立帕肽宿主DNA残留量进行了方法学研究,为该品种的质控标准提供依据。方法:根据中国药典2010年版三部的方法,分别对10 dose.mL-1和1 dose.mL-1 2个样品浓度的宿主DNA残留量检测进行了方法学研究。结果:研究表明特立帕肽原液2个浓度的宿主DNA残留检测均符合系统适用性要求。特立帕肽注射液的10 dose.mL-1浓度对加样回收有一定干扰,不能保证加样回收测定均符合规定,而1 dose.mL-1浓度的注射液在10 ng和1 ng的加样回收均没有干扰,因此将1 dose.mL-1样品浓度作为宿主DNA残留量检测浓度。对1 dose.mL-1样品浓度分别进行了1 ng、0.1 ng的加样回收测定,结果均符合要求。对3批特立帕肽原液和注射液检测结果表明每1剂量的宿主DNA残留量均小于10 ng。结论:该方法检测灵敏度较高,特异性较强,操作较安全简便,可用于特立帕肽的质量评价及进口检定。

核酸疫苗药代动力学的研究进展

核酸疫苗的药代动力学特性不同于通常的小分子药物 ,也不同于大分子的蛋白多肽类生物技术药物 ,因此 ,利用分子生物学技术建立核酸疫苗药代动力学研究方法学 ,对于其顺利进入临床试验 ,进而投入临床应用有着重要的意义。本文综述了核酸疫苗在机体内的生物分布特点、研究方法学、现存方法的局限性及安全性方面的研究进展。

阈值法检测人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量

目的建立人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量的阈值检测法,并进行验证。方法验证阈值法的线性范围、准确性及精密度。采用阈值法和DNA探针杂交法分别对3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量进行测定,并进行比较。结果DNA标准品浓度为3~200pg时,与检测信号(μV/s)呈良好的线性关系,直线回归方程为y=10.812x-36.761,R^2=0.9945;加入100和25pgDNA标准品的样品回收率为88%~110%,CV分别为7.7%和7.4%;精密度各次检测CV均<10%。阈值法检测3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量分别为181.9、104.2和64.6pg/mL,DNA探针杂交法检测结果分别为约250、约100和<100pg/mL,二者检测结果相符。结论阈值法有望应用于生物制品宿主细胞残留DNA含量的常规检测,且具有良好的准确性及精密度。

不同方法在宫颈癌筛查中的临床应用价值

目的:探讨不同方法在临床宫颈癌筛查中的应用价值及可行性。方法:将2005年6月～2008年6月在温州市龙湾区第一人民医院妇产科就诊且自愿接受筛查的妇女随机分成HPV-DNA组、TCT组和HPV+TCT组,每组310例,分别进行高危型HPV杂交捕获法二代检查(HC2)、TCT及两种同时检查,3组阳性病理均在阴道镜下定位行宫颈活检病理检查。比较3组阳性病例与病理检查结果的阳性符合率。结果:HPV-DNA组检出阳性49例,占15.8%;病理检查阳性29例,阳性符合率59.2%。TCT组检出阳性38例,占12.3%;病理检查阳性26例,阳性符合率68.4%。HPV+TCT组同时检出阳性18例,占5.8%;病理检查阳性17例,阳性符合率94.4%。结论:HPV-DNA联合TCT与病理检查的阳性符合率明显高于其中单项检查与病理检查的阳性符合率,其用于宫颈癌的筛查准确率高、漏诊率低。

红色毛癣菌的基因分型研究

目的探讨探针与DNA印迹杂交法对红色毛癣菌的基因分型并分析其基因型与来源地区的相关性。方法用溴化十六烷基三甲铵(CTAB)法提取DNA,以皮肤癣菌的特异性引物NS5犤5'-AACTTAAAGGAATTGACGGAAG-3'犦与ITS4犤5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'犦为引物,以红色毛癣菌的标准菌株为模板,用PCR法扩增出其rDNA部分18S区、ITSⅠ区、5.8S区和ITSⅡ区为探针,用随机引物法将探针标记32P,用EcoRⅠ酶切基因组DNA,采用DNA印迹的标准流程将酶切的基因组DNA与探针杂交;显示的不同带型,以此作为红色毛癣菌基因分型的依据。结果所试49株红色毛癣菌(南京21株、大连26株、北京2株)分为20型(A-T型),其中A-C型占48.98%。南京株绝大多数为3条带,大连株大部分为4条带。结论用ITS区域探针与DNA印迹杂交法对红色毛癣菌基因组分型敏感性强、分辨力高;南京与大连两地区红色毛癣菌DNA分型具有明显差异。DNA分型对红色毛癣菌病的流行病学、临床疗效的判定以及指导用药均具有重要价值。