用SSR标记建立玉米黄早四DNA标准指纹图谱的方法研究

DNA标准指纹图谱是分子检测技术用于玉米新品种选育及其DUS辅助评价的重要基础。通过玉米对黄早四DNA的SSR标准指纹图谱构建方法的研究。筛选出20对可以用于玉米DNA标准图谱构建的核心引物，它们的平均PIC值为0．8554，检测出的等位基因数是6～15个，平均8．55个。Bnlg125和Bnlg2162检测到了玉米黄早四的DNA特有谱带；8％的聚丙烯酰胺电泳体系可以将亲缘关系很近的玉米品种区分开来。对玉米DNA标准指纹图谱的建立方法和DNA取样方法进行了深入探讨。

一种质粒DNA标准物质的定值数据统计及不确定度评定

为研制一种质粒DNA标准物质,应用紫外分光光度法(UV)和高分辨电感耦合等离子体质谱法(HR-ICPMS)对质粒DNA标准物质候选物的浓度进行测定,统计定值结果,并对测量的不确定度进行评定。最终,质粒DNA标准物质的浓度表示为(75.1±2.1)ng/μL(k=2)。

数字PCR法定量低浓度水平短链DNA标准物质的研究

该文研制一种低浓度水平的短链DNA标准物质,用于低浓度水平ctDNA检测过程的量值溯源,重点对低浓度水平的短链基因标准物质的定值方法进行研究。首先选取TP53基因的一段300 bp长度的序列作为标准物质的目标序列,以数字PCR方法为研究方法,优化引物探针设计,通过考察PCR扩增的效率可以达到98.6%,满足数字PCR方法扩增的要求;然后采用转基因玉米NK603质粒分子国家标准物质验证数字PCR方法定值的准确度和精密度;其次考察数字PCR方法定量低浓度短链DNA标准物质TP53的重复性和重现性分别为2.99%和5.23%;最后采用数字PCR方法8家单位联合定值确定标准物质TP53的终浓度为(613.85±9.12)copies/μL(k=2),实现了对低浓度水平短链DNA标准物质的定值。

美国法庭科学DNA标准物质

美国国家标准和技术研究所(NIST)的标准物质(SRM)目录中提供了5种人类DNA标准物质(SRM2390,2391,2391 a,2392,2395),这5种DNA标准物质可以为法庭科学DNA鉴定提供参考标准。本文介绍这5种DNA标准物质的组成和产生,以期为我国进行相关研究提供借鉴和参考。

一种特异性检测单增李斯特菌的质粒DNA标准物质

研制了一种质粒DNA标准物质,包含目前单增李斯特菌检测常用的靶基因序列——内化素基因(Inl A)序列,可适用于扩增Inl A基因的单增李斯特菌PCR相关检测方法。采用紫外分光光度法(UV)和高分辨电感耦合等离子体质谱(HR-ICP-MS)两种方法,多家实验室联合定值的方法,对该套标准物质的均匀性、稳定性、量值以及不确定度进行详细的考察,质粒DNA标准物质的最终定值结果为94.9(±5.1)ng/μL。该质粒DNA标准物质可用于微生物实验室对单增李斯特菌PCR相关检测进行检测结果质量控制、开展方法比对和能力验证等。

国产法医DNA检验试剂耗材检测DNA标准品的准确性研究

目的利用法医DNA标准品对自主研发的法医DNA检验试剂耗材进行电泳检测准确性的实验考查。方法实验平台分为2个:平台1全部由美国Applied Biosystems公司进口的3130xl遗传分析仪、16道电泳毛细管与甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶构成;平台2由Applied Biosystems公司进口的3130xl遗传分析仪、16道电泳毛细管与本实验室研发的甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶构成。在实验平台上对allelic ladder、内标等标准品以及阳性对照9947a的STR复合扩增产物进行电泳检测,利用GeneMapper软件对电泳结果进行分析。结果自主研发的法医DNA检验试剂耗材可与国外进口的3130xl遗传分析仪配套使用,构建的实验平台对法医DNA标准品的检测结果准确无误。结论自主研发的甲酰胺、电泳缓冲液、凝胶等法医DNA检验试剂耗材检测准确性达到了国外同类产品水平。

人D6S1043-1型STR质粒DNA标准物质的研制

短串联重复序列(short tandem repeat,STR)是存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列,由含2~6个碱基对的重复单位串联构成。DNA STR分型检验是当前法庭科学进行个体识别和亲缘鉴定的主要依据。STR分型标准物质是DNA STR检验量值溯源的基础和关键物质,对其进行研究将极大推动我国法庭科学DNA STR检验的标准化进程。以STR基因座D6S1043为例,介绍人类基因组中STR序列的质粒DNA标准物质的制备过程。首先,合成包含13个重复单元([ATCT]13)的D6S1043序列(定义为D6S1043-1)并将其与pUC57载体连接构建重组质粒,制备质粒溶液。其次,通过酶切鉴定、Sanger测序、多种STR分型试剂盒的分型鉴定等方法检验DNA序列的准确性。再次,采用微滴式数字PCR方法(droplet digital PCR,ddPCR)检测质粒浓度,评估质粒溶液的均匀性和稳定性。最后,由8家实验室协作,测定浓度标准值,综合分析均匀性检验、稳定性检验、定值过程等引入的不确定度,得到总不确定度;由6家实验室协作,测定D6S1043-1的分型值。结果表明:该标准物质的均匀性、稳定性良好,在-20℃可保存6个月,在4℃可保存14 d;核酸拷贝数为(7.7±1.2)×10^3 copies·μL^-1;在D6S1043基因座上的分型值为13。人D6S1043-1型STR质粒DNA标准物质[编号:GBW(E)091072]是我国法庭科学DNA检验领域首批有证标准物质之一,其研制过程为其他STR基因座的质粒DNA标准物质的研制提供了一定的借鉴。

HER2基因组DNA标准物质互通性研究

采用实验室建立的数字PCR方法 (ddPCR)和荧光定量PCR (qPCR)方法研究HER2基因组DNA标准物质的互通性,评价HER2基因组DNA标准物质与临床样本的互通性,为临床实验室检测提供具有互通性的可溯源标准物质.将研制的5个水平标准物质随机穿插于29例临床样本间,使用ddPCR方法与qPCR方法同时进行检测.参考美国临床实验室标准化协会(CLSI)指南文件EP30和中华人民共和国卫生行业标准基质效应与互通性评估指南WS/T356-2011的推荐,采用Deming回归法评价标准物质的互通性.结果显示,5种标准物质与临床样本之间具有良好的互通性,可以用于临床实验室对HER2基因拷贝数变异检测方法的方法验证和质量控制.

法医DNA标准物质备选细胞STR等位基因片段长度的定值

目的研究建立法医DNA标准物质备选细胞基因组STR基因座等位基因片段长度标准定值的方法。方法利用有机法提取HPF和HSSM细胞基因组DNA并进行STR复合扩增,将产物进行电泳检测。利用Gene Mapper软件分析电泳结果,记录STR基因座等位基因的数值,并对目前我国公安系统应用较为广泛的DNATyperTM15、IdentifilerTM两种试剂盒扩增产物进行相应的DNA片段长度(bp)统计以及定值。结果 HPF为男性个体细胞,HSSM为女性个体细胞。HPF和HSSM细胞DNATyperTM15系统等位基因片段长度范围分别为126.26±0.05～367.53±0.20bp和125.33±0.07～370.08±0.17bp,IdentifilerTM系统等位基因片段长度范围分别为117.22±0.04～340.02±0.08bp和117.21±0.03～323.86±0.09bp。结论对STR基因座等位基因片段长度进行标准定值,可为法医DNA标准物质提供有效的溯源途径。

大肠杆菌多重耐药基因AcrA、AcrB内标准DNA的构建

在克隆AcrA、AcrB部分基因片段并进行基因及编码蛋白的同源性分析的基础上,设计合成构建AcrA、AcrB的内标准DNA所需引物,经过3次(12个)PCR成功地合成了AcrA、AcrB的内标准DNA。合成法构建定量RT-PCR内标准DNA快捷、成功率高。

利用PCR技术快速制备DNA分子量标准物

目的:制备一套DNA分子量标准物。方法:利用多聚酶链式反应技术(PCR),以连接有9个不同大小DNA片段的pMD18-T载体为模板,M13引物为通用引物,进行大规模扩增,并进行2%琼脂糖凝胶电泳分析和利用TanonGIS凝胶图像处理系统对凝胶扫描及拍照。结果:DNA分子量条带大小依次为1653bp、1173bp、691bp、606bp、496bp、401bp、326bp、238bp、155bp,条带分布适度、亮度清晰。结论:制备了能满足研究和实验室的要求DNA分子量标准物,和市售的相比,成本大大降低。

一种用于形成1kb阶梯DNA分子量标准载体的构建

构建了2个用于产生DNA分子量标准的载体pTLK3和pTLK5。pTLK3由1.0,2.0,4.0和5.0 kb 4个部分组成,经ApaI完全酶切后再用EcoRI部分酶切,可以得到1.0～8.0 kb以及12.0 kb的条带。pTLK5由3.0,0.5和1.5 kb 3个部分组成,用EcoRI完全酶切将得到3.0,0.5和1.5 kb 3种大小的片段。将pTLK3和pTLK5的酶切产物混合,得到1.0 kb阶梯的DNA分子量标准,其条带分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、12.0 kb的条带。此分子量标准适合0.5～8.0 kb的DNA的分子量测定,适用范围较广。

一种简便的DNA定量分子量标准的制备

目的:制备一种具有琼脂糖凝胶电泳定量功能的DNA分子量标准。方法:以pMD18-TSimple载体为基础骨架构建了长度为4.7kb的质粒,应用定点突变的方法,在载体上分别间隔100bp、200bp、400bp、800bp、1200bp处,加入了HindⅢ限制性内切酶的酶切位点,将该质粒扩增后并应用HindⅢ酶切后,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果:获得的分子量条带大小依次为100bp、200bp、400bp、800bp、1200bp和2000bp,每次使用4μl可获得质量范围为10ng、20ng、40ng、80ng、120ng和200ng的定量标准品。结论:应用该方法制备标准品,具有制备简单、成本低、定量快速等优点。

基于改进的重叠延伸聚合酶链式反应技术快速制备DNA分子质量标准

采用改进的重叠延伸聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,简便、快速地制备DNA分子质量标准。首先,利用普通PCR技术扩增5 和3 两端序列一致的DNA片段。随后,在重叠延伸PCR的变性和退火过程中,2个单链的3 端互补序列可形成双链,且这些单链片段可同时作为模板和引物,在PCR延伸过程中延长片段。随着反应循环数的增加,小片段产物逐渐减少,大片段产物逐渐增多。取不同循环数的重叠延伸PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,根据电泳结果选择最佳的PCR循环数或不同循环数的最佳组合,无须回收纯化,即可得到分子质量相差100bp的DNA分子质量标准。经琼脂糖凝胶电泳检测,所制备的DNA分子质量标准条带清晰、分子质量准确、条带均一性好,可用于标记DNA分子质量大小。总之,本研究用于DNA分子质量标准制备的方法操作简单,周期短,成本低,无副产物,且能够根据具体需求定制DNA分子质量标准的大小。

基于DNA-记忆元胞自动机与Hash函数的图像加密算法

为有效防止图像信息在网络传输中被攻击,提出基于DNA-记忆元胞自动机与Hash函数的低延迟图像加密认证算法。迭代2DLogistic混沌映射,输出混沌序列,引入位置集合混淆技术,扰乱明文像素位置,形成置乱图像;定义迭代时延函数,将其嵌入2DTinkerbell混沌映射中,形成低时延混沌序列,建立DNA的标准规则;利用DNA标准规则,将置乱图像转变成随机性强的DNA序列;综合考虑多个时刻的元胞状态,改变其局部转换规则,改进元胞自动机,使其具备记忆功能,联合DNA序列,构造像素扩散联合模型,对混淆密文进行加密,彻底篡改其像素值,有效提高算法的抗攻击能力;融合Hash检测函数,通过检测扰乱密文的与置乱图像的Hash值,对图像信息的真伪完成认证。实验结果表明,与当前图像加密算法相比,所提加密技术具备更高的安全性与抗差分攻击特性,面对各种攻击时,该算法的用户响应更高。

标准品制备方法对FQ-PCR定量基因表达水平的影响

实时荧光定量PCR(FQ-PCR)标准曲线法准确定量基因表达的关键在于标准品与待检样本的扩增效率是否一致.为检测DNA标准品与样本cDNA扩增效率的一致性,探讨定量用标准品的最佳制备方法,本研究以脂肪酸结合蛋白5(Fabp5)、过氧化物酶体增殖活化受体α(Ppar-α)及β肌动蛋白(β-Actin)的3个基因为对象,分别采用质粒纯化法、PCR产物直接纯化法、PCR产物凝胶回收法制备DNA标准品,10倍梯度稀释后用FQ-PCR制作标准曲线.并以10倍梯度稀释的样本cDNA标准曲线的参数为对照,进行比较分析.结果表明,不同方法制备的DNA标准品的扩增效率差异较大,并且与cDNA的扩增效率不一致,不能对cDNA样本进行准确定量.另外,虽然目的基因在cDNA样本中的拷贝未知,不能对基因表达水平进行绝对定量,但因不同cDNA样本的同一基因的扩增效率一致,可对基因的表达进行准确的相对定量.

基于PCR技术快速制备DNA Marker的研究

DNA Marker是一组分子量大小已知的DNA片段混合物,用于指示核酸电泳中未知样品的分子量大小。基于PCR方法,设计了不同的引物对,以质粒p32a-CP为模板,分别扩增出大小为2kb、1kb、750bp、500bp、250bp、100bp的DNA片段,初次制备出DNA Marker,并参照商品化的DM2000按一定的比例混合各片段进行优化。经1%琼脂糖凝胶电泳检测,所制备的DNA Marker(命名为DL2000)质量稳定、条带清晰、分布均匀,在分子生物学试验中可用于标记DNA大小。

转基因检测标准物质研制关键环节质量控制研究

在转基因产品检测方法开发、身份鉴定和产品成分定性、定量检测过程中,标准物质是不可缺少的物质基础。本研究对标标准物质申报要求,着重对比了基体标准物质、基因组DNA标准物质、质粒标准物质三种类型转基因检测标准物质的研制过程,提出关键环节的质量控制要求,为促进转基因检测标准物质研制过程标准化、提升研制报告编制质量、提高申报通过率提供技术支撑。

DNA Ladder的制备

背景:目前,制备DNA分子量标准的方法主要有2种,一种是用限制性内切酶消化某种DNA,另一种是利用PCR扩增,2种方法各有优缺点。在前期采用PCR技术在前期扩增100～500bp片段的基础上,实验室又成功扩增出600～1000bp片段,PCR产物经过纯化,混匀,制备的DNA Ladder,结果制备DNA Ladder的条带清晰,易于识别,可完全与公司商品化的DNA Ladder相比,完全可用于分子生物学实验。目的:利用PCR扩增技术制备DNA分子量标准参照物。方法:自行构建了一种特殊适宜扩增的质粒pUC-DNA,根据pUC-DNA的基因序列,利用primer5.0设计能特异扩增100～1000bp的PCR引物。PCR扩增出100～1000bp大小的DNA片段,在2%琼脂糖凝胶中电泳观察结果。用凝胶回收试剂盒回收目的PCR产物,测序结果与pUC-DNA上基因序列进行序列比对,Blast进行同源性分析。将PCR产物用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀,按比例混匀,即可使用。结果与结论:利用PCR技术能够成功扩增出100～1000bp条带,片段大小与预期结果相符,片段序列与GenBank序列完全一致,利用回收片段制备的DNA Ladder条带清晰,可与同类产品相比。

伤寒沙门氏菌质粒DNA参考物质的研制

目的制备包含伤寒沙门氏菌的三种检测靶标序列se、st、aceA的质粒DNA参考品。方法设计一种质粒DNA包含目前用于沙门氏菌检测和分型常用的se、st、aceA的质粒(pDNA Salmonella),对其序列的稳定性,均一性和量值可追溯性进行评价,并验证其与沙门氏菌基因组DNA参考品在实时定量PCR应用中的可比性。结果经多个实验室定值后,pDNA Salmonella最终定值结果为30.08μg/mL pDNA。Salmonella均一性,稳定性良好,可在-20℃长期保存,并且在实时定量PCR应用中与基因组参考品具有可比性。结论 pDNA Salmonella具有良好的序列准确性和可追溯性,这项研究重点是证明了快速合成的质粒作为鉴定伤寒沙门氏菌qPCR参考品的可行性。