蛋白酶消化结合荧光定量PCR法和杂交法检测重组人胰岛素中E.coli细胞DNA残留量的比较

目的:利用蛋白酶K消化结合荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)技术,检测重组人胰岛素原料中E.coli细胞DNA残留量,并进行初步的方法学验证,与狭缝杂交-放射自显影方法进行比较。方法:通过蛋白酶K消化样品,利用核酸纯化提取试剂盒提取DNA,然后采用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,再根据标准曲线对样品中DNA残留量进行分析。对方法进行线性、范围、准确度和精密度的验证,对重组人胰岛素中DNA残留量进行测定。结果:该方法检测E.coli细胞DNA残留的最低定量限度为0.03 pg·μL^(-1),DNA含量在0.03~2.25×10~3 pg·μL^(-1)范围内线性关系良好,相关系数在0.98以上;该方法检测不同加标样品回收率较接近,3次测定的相对标准偏差均小于20%;该方法检测各批次重组人胰岛素的DNA残留量均小于10 ng·剂量^(-1),而狭缝杂交——放射自显影法50 pg(标准DNA)均未出现条带。结论:蛋白酶消化结合试剂盒洗脱解决了残留DNA检测中样品前处理的难题,定量PCR检测可能代替杂交法,快速、准确、灵敏地对重组人胰岛素原料中E.coli细胞残余DNA进行定量测定,为将来荧光定量PCR检测药物中宿主DNA残留方法标准化奠定了基础。