核酸适配体筛选中单链DNA制备方法的研究进展

核酸适配体是人工合成的短链核酸,作为分子识别元件,能够与各类靶标物质高特异性、高亲和力的结合,分为单链DNA和RNA两种类型。其中单链DNA适配体由于其稳定性比RNA适配体更好而更受欢迎,因此得到广泛应用。核酸适配体筛选通常是通过配体指数富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)实现的,筛选能否成功在很大程度上取决于其最关键的单链制备步骤,即将双链DNA转化为相应的单链DNA。目前,存在许多方法可以制备单链DNA,包括热变性法、生物素-链霉亲和素亲和分离法、变性胶电泳分离法、核酸外切酶消化法、不对称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法等。本文在总结文献报道的基础上,具体阐述了各种单链DNA制备方法的原理、优缺点及近5年的应用情况,并对这些单链DNA制备方法进行了比较和展望,以期能为成功筛选各类靶标的核酸适配体提供参考。

对单细胞凝胶电泳法检测细胞核DNA损伤的影响因素

目的 :探讨对单细胞凝胶电泳法 (SCGE)检测细胞核DNA损伤的影响因素。方法 :结合一氧化氮对食管癌细胞系EC10 9细胞核DNA的损伤作用模型 ,对SCGE实验中的影响因素等进行分析讨论和综合评价。结果 :受试物的浓度及其对细胞的作用时间、细胞周期等是SCGE实验中的主要影响因素。结论 :SCGE中的一些因素对实验结果有显著影响。

“彗星”电泳法在DNA损伤与修复检测中的应用

单细胞琼脂电泳(SCGE,Single Cell Gel Electrophoresis)又称彗星电泳法(COMET ASSAY)是一种操作简便、快速、敏感性高的DNA损伤与修复的检测技术。该方法在检测放射和化学性致癌、致突变物质所引起的DNA损伤方面有其独特的优点:1)此法无需复杂的实验条件,;2)样品分析只需4～6小时,为现场调查和大生物样本的研究提供了可能性;3)此法检测的是单细胞的DNA损伤,比以前已知的各种细胞水平的致突变检测方法更为敏感;4)所需样品量小,外周血只需30μl左右;5)无需放射性示踪剂,因此突破了传统的局限。

琼脂糖凝胶中DNA的一种长期保存法

有时因时间仓促或另有要事不能及时将凝胶电泳结果照相,有时需要将凝胶板留作参考或比较,这些都要求保存凝胶电泳中的DNA条带,防止DNA的扩散。常规的方法是将凝胶板置于10％乙醇4℃保存,但这种方法仅能减缓DNA扩散。澳大利亚新威尔士大学微生物学与免疫学院David Jacobs等发明了一种长期保存琼脂糖凝胶中DNA的方法。此法非常简便。

野油菜黄单胞菌基因组DNA快速提取方法和酶切

本文建立了一种野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)基因组DNA的简便快速提取方法。用去污剂SDS和CTAB破坏细胞膜结构,使胞内核酸释放,用酚/氯仿/异戊醇去除蛋白质,经异丙醇沉淀DNA,TE溶解DNA。采用此SDS和CTAB结合的方法提取的DNA琼脂糖电泳图谱与试剂盒UNIQ-10提取的基因组DNA及D-5010A试剂盒法提取的基因组DNA图谱相同,DNA经紫外分光光度计检测OD260/OD280在1.80～1.90之间。DNA能被EcoRI、XbalI酶切消化。本方法能快速简便地提取野油菜黄单胞菌DNA,提取的DNA含量较高、纯度较好,比试剂盒更经济,也可用于酶切分析、构建文库和PCR扩增。

超声波破碎法提取活性污泥DNA及其DGGE分析

为快速提取活性污泥中的微生物DNA,进一步应用于变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析其群落结构,采用细胞超声波破碎法直接提取反应器活性污泥DNA,以16S rRNA V3区域通用引物进行PCR扩增,随后利用DGGE技术对扩增产物的多样性进行评估.结果表明,超声波破碎法可以快速地提取活性污泥DNA,用超声波破碎法提取到的活性污泥克服了PCR扩增困难的问题.在一定的超声波功率下,超声时间对DNA产率、PCR扩增效率和DGGE分析均有很大影响,实验的最佳超声时间为27 s.DGGE分析表明,用该法提取到的DNA种类较为丰富,多样性较好,种群强度最高能达到0.7 OD,能够进一步应用于群落结构分析.

彗星电泳法在植物原生质体凋亡检测中的应用

应用中性法彗星电泳检测烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）原生质体的凋亡。结果表明，彗星发生的百分率（彗星率）和发生核质固缩及“核着边”（凋亡形态学标志）的细胞的百分率之间存在明确的相关性。利用标准的细胞凋亡检测手段，包括ＤＮＡｌａｄｄｅｒｉｎｇ及核糖核酸末端转移酶介导的ｂｉｏｔｉｎｄＵＴＰ缺口末端标记（ＴＵＮＥＬ），都证明这种彗星电泳法可以用来比较精确地检测植物原生质体的凋亡。

SDSC-TAB和高盐沉淀法提取香蕉枯萎病菌基因组DNA的比较

以香蕉枯萎病菌菌株为试验材料 ,采用SDS- CTAB法和高盐沉淀法提纯香蕉枯萎病菌基因组DNA。结果表明 :高盐沉淀法是适合于香蕉枯萎病菌基因组DNA提取的方法。该方法提取的DNAOD2 60 2 80值显示产物纯度较高 ;经琼脂糖凝胶电泳得到一条带型较宽且清晰的DNA谱带 ,DNA浓度较高 ,基本无DNA碎带 ;不用RNase处理 ,已无RNA的干扰 ,无需任何纯化处理即可用于PCR扩增和RAPD分析。同时对DNA提取过程中的细节问题进行了探讨与分析。

质粒DNA构型分离和分析方法研究进展

作为基因传递的载体,质粒DNA已被广泛应用于DNA疫苗和基因治疗。质粒DNA存在不同的构型,其中超螺旋构型的质粒在细胞中的转染和表达效率最高。美国食品与药品监督管理局在2007年发布了质粒DNA疫苗的工艺指导原则,建议超螺旋构型的比例大于80%,因此建立高灵敏度和高分辨率的方法用于质粒DNA构型分离和分析具有重要意义。就近年来质粒DNA构型的分离和分析方法进行了综述,主要包括琼脂糖凝胶电泳法、液相色谱法和毛细管凝胶电泳法,并对未来质粒DNA构型分离和分析方法的发展提出了展望。

改良聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA

本文介绍了应用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA的改进方法。与以往方法相比,本方法从配制凝胶储备液,无需封口的水平灌胶,适当地提高电泳的电压梯度,采用改良银染法检测,省却凝胶固定,银染法DNA的纯化方法,及溴化乙锭染色法的操作等一系列改进措施,使聚丙烯酰胺凝胶电泳检测DNA的操作得到简化,更便捷,并减小了对人与环境的毒害作用。

一种经济、快速的凝胶DNA回收方法

目的:用明胶海绵吸收法回收DNA片段,并验证该方法能否有效、快速的从电泳后琼脂糖凝胶中回收DNA片段。方法:将明胶海绵剪成楔形,在紫外灯照射下插入含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶中,待海绵完全膨胀后取出,离心收集DNA溶液;并用该法回收的DNA片段进行PCR扩增,检验其回收的DNA质量。结果:明胶海绵吸收法回收DNA样品的得率介于63%～98%,所回收的DNA进行PCR扩增能够获得相应的目的条带。结论:明胶海绵吸收法是一种快速、有效的DNA回收方法。

黄连木叶片基因组DNA提取方法

黄连木叶片中酚类化合物、色素、多糖和其它次生代谢物质含量较高,这给黄连木基因组DNA提取带来困难。为了从黄连木叶片中提取高质量基因组DNA,本文运用CTAB法和改良CTAB法提取黄连木基因组DNA,通过定性、定量及PCR分析检测所提取DNA的质量。结果表明:改良CTAB法提取的DNA电泳条带清晰无RNA等污染,OD260和OD280比值在1.8左右,RAPD扩增条带清晰、无弥散现象、亮度均一。说明改良CTAB法提取的DNA纯度较高,适用于PCR扩增反应。

鲫鱼基因组DNA提取方法的探讨

以鲫鱼的血液、肌肉、肝、肾为材料,采用苯酚-氯仿法、试剂盒法提取鲫鱼基因组DNA,对不同方法提取的结果进行了紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳、微卫星PCR扩增等方法的鉴定。结果表明不同方法提取的鲫鱼基因组DNA浓度在385.8～3167.5ng/μL,A260/280比值处于1.66～1.87,所提取的DNA适合微卫星PCR扩增。因此,用苯酚-氯仿法对鲫鱼的血液、肌肉、肝、肾,用试剂盒法对鲫鱼的血液均能提取鲫鱼基因组DNA。

凝胶滞留电泳法测定大鼠肝组织细胞核NF-κB结合活性

应用大鼠肝组织细胞核蛋白提取物与特异的NF -κB基因探针序列结合 ,经凝胶滞留电泳分析其结合能力。方法操作简便易行、重复性好。该方法的建立 ,为进一步研究核转录因子活性及其调控基因的表达 。

全血DNA提取试剂盒改良法

目的建立简便、快捷、高纯度、高浓度的DNA提取方法。方法对原美国生产的EZNABloodDNAKit试剂盒方法进行改良(简称全血DNA提取试剂盒改良法),并与原试剂盒法、经典酚氯法改良法(微量法)[1]进行比较。取EDTA2Na抗凝血,分别用3种方法提取DNA,用琼脂糖凝胶电泳对其进行定性测定,并用紫外分光光度法定量测定。结果DNA提取的纯度A260/A280试剂盒改良法、原试剂盒法和微量法分别为1.8083±0.1655、2.0877±0.3230、1.7734±0.1152,前两法有显著性差异(P<0.05),试剂盒改良法提取DNA的纯度明显高于原试剂盒法,与微量法无显著性差异(P>0.05);改良法提取DNA的浓度分别为75.2476±18.0259、45.2771±14.973、123.8758±74.7367,与前两法的DNA提取浓度有显著性差异(P<0.05),明显高于原试剂盒法;DNA电泳图显示试剂盒改良盒法与微量法均很清晰,原试剂盒法有明显的拖尾现象。结论试剂盒改良法提高了DNA提取的纯度和浓度,可作为分子生物学研究DNA提取较好的选用方法。

改良溴化乙锭染色法快速检测基因组DNA

目的探讨一种耗时少、检出率高的基因组DNA检测方法。方法采用改良的溴化乙锭染色法检测提取到的样本基因组DNA。采用分光光度仪进行敏感性验证,聚合酶链式反应确认该方法能否用来检测PCR产物。结果改良的溴化乙锭染色法显著减少基因组DNA的上样量,提高基因组DNA的检测敏感性,节省操作时间,无需loading buffer,并可粗略估计基因组DNA浓度。结论改良的溴化乙锭染色法只适用于初筛样本基因组DNA,不能用于评估DNA片段的长度。

一种改进的水稻总DNA的快速提取方法

植物总DNA的提取质量是植物分子生物学操作成败的关键 ,一个优秀的总DNA提取方法往往可以达到事半功倍的效果。本文以水稻叶片为材料 ,提出了一种改进的植物叶片总DNA快速提取方法 ,该方法能在 35min之内提取到水稻总DNA。电泳结果表明此改进方法提取的总DNA产量与传统CTAB法相当 ,PCR扩增结果表明其质量可靠 。

一种从口腔拭子中提取DNA的简易方法

目的应用简便方法提取口腔拭子中DNA,并用特异引物扩增,评估该方法的应用价值。方法用1×PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液在PCR仪上对口腔拭子进行消化,并以该产物为模板,应用角蛋白5基因1号外显子及1号染色体上2个微卫星标记特异性引物扩增,目的片段分别用于测序和毛细管电泳。结果通过上述方法可获得用于PCR反应及后续基因测序及微卫星标记毛细管电泳分型的足量DNA。结论利用PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液从口腔拭子中提取DNA是一种简单、高效、快速、低成本的方法,更是一种无创的采样方法。

聚丙烯酰胺凝胶制备及电泳中常见问题及克服方法

种子纯度是衡量杂交种子质量的主要指标．纯度低的种子给农业生产带来严重的损失。传统纯度鉴定多采用大田形态鉴定法，但它周期长、工作量大，有时无法及时满足经营工作的需要。近年来．生化标记和DNA分子标记技术得到日益广泛的应用．都是借助于聚丙烯酰胺凝胶电泳将具有品种特异性的谱带分离出来，进而判定纯度和真实性，具有速度快、时间短等优点．但电泳技术的熟练程度直接影响到电泳谱带的清晰度与分辨率。

蚧虫基因组DNA不同提取方法的比较

实验以日本龟蜡蚧CeroplastesjaponicusGreen,白蜡绵粉蚧PhenacoccusfraxinusTang ,朝鲜球蚧DidesmococcuskoreanusBorchseniush和瘤大球坚蚧EulecaniumgiganteaShinji等 4种蚧虫为材料 ,分别用十二烷基硫酸钠 (SDS)法、十六烷基三乙基溴化铵 (CTAB)法、醋酸钾 (KAc)法和氯化钠 (NaCl)法等 4种方法 ,对单只蚧虫进行基因组DNA提取 ,用 0 8%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA。结果表明 ,4种方法都可以提取到基因组DNA ,但是比较而言 ,CTAB法和NaCl法所提取的DNA质量明显优于SDS法和KAc法 ,并适用于PCR。因此认为 ,CTAB法和NaCl法是实验室提取单只蚧虫基因组DNA更有效而实用的方法。