表达谱芯片与DNA甲基化芯片综合分析探索鼻咽癌发生、发展的分子靶标

目的综合分析表达谱芯片与DNA甲基化芯片,探索鼻咽癌发生、发展的分子靶标与潜在治疗靶点。方法在GEO公共数据库下载编号为GSE64634的表达谱芯片数据以及编号为GSE52068的DNA甲基化芯片数据;利用R语言的相关工具包对表达谱芯片进行差异表达分析,对DNA甲基化芯片进行差异甲基化位点分析;利用DAVID数据库对筛选出的差异表达基因进行基因功能分析和信号通路分析;利用实时荧光定量PCR和甲基化特异性PCR进一步验证生物信息学分析的结果。结果表达谱芯片分析获得筛选出2 327个差异表达基因,其中1 777个基因表达下调,550个基因表达上调;DNA甲基化芯片分析获得2 321个差异甲基化位点,其中2 228个低甲基化位点,93个高甲基化位点;对表达谱芯片和DNA甲基化芯片进行综合分析,找到4个表达水平升高且甲基化修饰水平降低的基因,并利用定量PCR、表达谱芯片和DNA甲基化芯片成功验证该结果。结论综合分析表达谱芯片和DNA甲基化芯片,筛选出4个与鼻咽癌发生、发展相关的分子靶标和潜在的治疗靶点。

ILLUMINA Golden Gate DNA甲基化芯片的KL-FCM聚类分析

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰,其甲基化水平被发现与疾病的发生发展密切相关,对其进行聚类分析有希望发现新的疾病亚型并建立有效的疾病预测预后方法。传统的聚类分析方法之一模糊C-均值(FCM:Fuzzy C-means)适用于特征空间呈球形或椭球形分布的场景,缺乏普适性。而Illumina Golden Gate平台通过计算基因的各甲基化位点的甲基化百分比描述其甲基化程度,其值位于(0,1)之间,服从混合贝塔分布,不能直接采用FCM进行聚类分析。鉴于此,本文提出基于KL特征测度的KL-FCM聚类算法,采用各样本间的K-L距离作为样本划分时的度量准则。最后,本文基于KL-FCM算法实现IRIS测试数据集和基因的DNA甲基化水平数据的聚类分析。实验结果表明该方法可以以更低的计算负荷获得优于k-均值(k-means)和传统FCM的分类效果。

表达谱芯片和DNA甲基化芯片联合分析筛选克罗恩病发生、发展的分子靶标

目的 通过生物信息学方法筛选与克罗恩病(CD)发病相关的异常甲基化修饰的差异表达基因。方法 从公共基因表达数据库(GEO)下载CD的表达谱芯片GSE102134和DNA甲基化芯片GSE105798。通过R语言软件对CD表达谱芯片进行差异表达分析,同时对CD的DNA甲基化芯片进行差异甲基化位点分析。筛选异常甲基化修饰的差异表达基因进行功能富集分析。STRING数据库和Cytoscape软件共同构建蛋白相互作用网络,筛选CD的核心基因。最后通过GEO数据库GSE75214和GSE186582验证差异基因表达。结果 采用表达谱芯片分析,共筛选出1315个差异表达基因,其中780个表达上调,535个表达下调。CD组与对照组比较,共发现11066个差异甲基化位点,其中8542个高甲基化位点,2524个低甲基化位点。对差异表达基因和差异甲基化基因进行联合分析,找到55个低甲基化修饰下表达上调的基因,和125个高甲基化修饰下表达上调的基因。GO分析表明异常甲基化修饰的差异表达基因与跨膜转运蛋白活性、细胞顶端组成和有机阴离子转运相关。KEGG信号通路主要为PIK/Akt信号通路、黏附斑和ECM-受体相互作用等。STRING和Cytoscape软件筛选信号通路中的关键基因,并在GSE75214和GSE186582芯片集验证差异基因的表达,结果提示COL4A2、COL4A1、PDGFRB和PYY可能在CD中起重要作用。结论COL4A2、COL4A1、PDGFRB和PYY可能是CD疾病诊断和治疗的潜在靶点。

^(60)Coγ射线诱发小鼠DNA甲基化改变

目的探讨基因组启动子甲基化谱及DNA甲基化酶1(DNMT1)表达量在60Co-γ射线照射小鼠各组织的变化及其意义。方法 SPF级C57BL/6J雄性小鼠12只随机分为对照组和照射组,照射组小鼠接受4Gy60Co-γ射线单次全身照射后,均眼球摘除取血后处死,收集各脏器组织,进行外周血白细胞计数和骨髓嗜多染红细胞微核计数,应用甲基化DNA免疫沉淀-芯片(MeDIP-chip)杂交技术对γ射线照射小鼠肝组织基因组启动子(promoter)CpG岛甲基化改变进行分析,并采用免疫组化(SP)法和蛋白质印记(western blot)法检测小鼠各组织DNMT1的表达情况。结果与对照组比较,照射组小鼠基因组启动子甲基化谱发生了明显改变,照射组1 300个基因的启动子CpG岛发生了新的甲基化,660个基因发生去甲基化;提高筛选标准,最后可得到发生明显甲基化的基因有Trim71、Sema3f、Pcdh8、Sox4、1110034A24Rik、Limk1、Nefl、Xpr1,明显去甲基化的基因有Sfrs18、Dr1、Ankrd42、Nae1、Sfi1、Accn1、Srd5a1、Nsun2、Eif1a、Dusp5;照射组小鼠除肺组织外肝脏、肾、睾丸及脑组织的DNMT1表达量均高于对照组(P<0.05)。结论在电离辐射损伤中基因组启动子甲基化模式发生了改变,DNMT1表达增加可能是导致启动子发生甲基化的原因。

上海农村地区颈动脉内中膜增厚人群的表观遗传分子标志物研究

目的 通过甲基化芯片筛选颈动脉内中膜增厚相关基因的异常甲基化位点,探讨颈动脉增厚人群的遗传基础,预期筛选新型表观遗传标志物。方法选取2016年5月-2016年7月于上海市奉贤区青村镇体检者28例,所有研究对象均进行问卷调查和体检且完成颈总动脉内中膜厚度(common carotid artery intima-media thickness,CCA-IMT)超声检测,根据CCA-IMT厚度分为颈动脉内中膜增厚组和对照组,同时收集研究对象一般资料,进行体格检查及生化指标检测,收集静脉血冻存备用。利用Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip (850K芯片)对8例颈动脉增厚患者和8例健康对照的外周血全基因组甲基化水平进行检测,利用数据库GO分析(Gene Ontology Analysis,GO)、京都基因与基因组百科全书通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)进行生物信息学分析,筛选DNA甲基化水平显著变化的基因CpG位点,并对目的区域进行焦磷酸测序验证,以期筛选出颈动脉内中膜增厚相关的DNA甲基化分子标志物。结果通过芯片数据筛选及GO/KEGG pathway功能富集分析,差异甲基化位点共19073个,具有甲基化差异的基因共311个(|Δβ|> 0.2,P<0.05),涉及生物过程的674个功能条目,分子功能的111个功能条目,细胞组分的131个功能条目。经焦磷酸测序验证,与颈动脉内中膜相关的候选基因溶酶体氨基酸载体蛋白(human member 9 of the solute carrier family,SLC38A9)、前蛋白转化酶枯草溶菌素2 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 2,PCSK2)启动子区的CpG岛在颈动脉内中膜增厚患者较健康对照组甲基化程度显著降低(P<0.05)。结论上海农村地区颈动脉内中膜增厚人群与健康人群相比外周血全基因组呈现显著低甲基化,SLC38A9启动子区的cg00279662以及PCSK2启动子区的cg1 1048863可能是影响颈动脉内中膜厚度的DNA甲基化分子标志物。

雄激素非依赖性前列腺癌细胞中差异甲基化基因的初步筛选

应用全基因组DNA甲基化芯片(Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip)杂交技术以及转录组RNA测序技术,检测了雄激素依赖性前列腺癌(androgen-dependent prostate cancer,ADPC)细胞株LNCaP和雄激素非依赖性前列腺癌(androgen-independent prostate cancer,AIPC)细胞株LNCaP-AI(androgen independent)中的差异甲基化基因。发现与LNCaP细胞株相比,LNCaP-AI细胞株有990个CpG位点表现为高甲基化,涉及855个基因;2 305个CpG位点表现为低甲基化,涉及1 970个基因。结合转录组mRNA表达结果,筛选出6个超甲基化基因:FAM111B、RAB36、PCDH7、COL6A2、IGF1R、GULP1;8个低甲基化基因:EPHA3、TM4SF1、IGFBP5、FAM105A、RASD1、ITPR2、CYP27B1、UBE2E3。这些差异甲基化基因涉及钙离子信号通路、Wnt信号通路等多个信号通路,参与了细胞的基因表达、信号传导、细胞通讯、细胞运动、细胞黏附以及血管生成等功能,为探讨这些差异甲基化基因在前列腺癌雄激素非依赖性转化过程中发挥的作用奠定了基础。