血清嘌呤能受体P2X7及YTH结构域N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2与急性缺血性脑卒中患者静脉溶栓后出血转化的关系研究

目的探讨血清嘌呤能受体P2X7(P2RX7)及YTH结构域N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2(YTHDF2)与急性缺血性脑卒中(AIS)患者静脉溶栓后出血转化的关系。方法选取2020年1月至2023年12月陕西省康复医院收治的192例AIS患者作为AIS组(溶栓后又分为出血转化组和非出血转化组),另选取同时段150名体检健康者作为对照组。采用酶联免疫吸附试验法检测血清P2RX7、YTHDF2水平。以静脉溶栓后出血转化为因变量,建立Logistic回归模型,确定AIS患者静脉溶栓后出血转化的相关因素,绘制受试者工作特征曲线,评价血清P2RX7、YTHDF2水平对出血转化的预测价值。结果AIS组血清P2RX7、YTHDF2水平均高于对照组[(1.6±0.3)μg/L比(1.2±0.3)μg/L、(1.32±0.26)μg/L比(1.03±0.16)μg/L](均P<0.001)。出血转化组血清P2RX7、YTHDF2水平高于非出血转化组(均P<0.001)。多因素Logistic回归分析模型结果显示,美国国立卫生研究院卒中量表评分高、心源性栓塞、P2RX7水平高、YTHDF2水平高为AIS患者静脉溶栓后出血转化的独立危险因素(均P<0.05)。血清P2RX7联合YTHDF2预测出血转化的曲线下面积为0.886,大于P2RX7、YTHDF2单独预测的0.780、0.784(均P<0.001)。结论血清P2RX7、YTHDF2水平升高是AIS患者静脉溶栓后出血转化的独立危险因素,血清P2RX7联合YTHDF2检测对其有较高的预测价值。

DNA甲基转移酶与甲基化CpG结合结构蛋白2在胃肠间质瘤的表达

目的研究DNA甲基转移酶(DNMT)和甲基化CpG结合结构蛋白2(MBD2)在胃肠道间质瘤(GIST)的蛋白表达。方法采用免疫组织化学法与免疫印迹法对28例成人GIST标本及配对对照标本进行DNMTs与MBD2的蛋白表达研究。结果 DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3L、MBD2蛋白在GIST中表达显著高于配对对照组织,差异有统计学意义(P<0.05),但DNMT3a在GIST的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 GIST表达DNMTs(除外DNMT3a)和MBD2更显著。

血清胶质纤维酸性蛋白、甲基化CpG结合蛋白2对脑胶质瘤的诊断价值及其与病理特征的相关性分析

目的探讨血清胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)对脑胶质瘤的诊断价值及其与病理特征的相关性。方法回顾性选取2021年1月至2024年1月南京医科大学附属脑科医院(南京脑科医院)收治的80例脑胶质瘤患者,将其作为胶质瘤组,选取本院同期收治的80例非胶质瘤颅内良性肿瘤患者作为对照组。应用双抗体夹心法检测两组患者血清GFAP表达水平,应用荧光定量聚合酶链反应法检测肿瘤组织MeCP2表达水平。比较脑胶质瘤患者与对照组的GFAP、MeCP2表达水平,并建立ROC曲线分析GFAP、MeCP2对脑胶质瘤的诊断价值。分析不同病理特征脑胶质瘤患者GFAP、MeCP2表达水平,并采用Spearman相关性分析GFAP、MeCP2与脑胶质瘤病理特征的相关性。结果胶质瘤组患者GFAP、MeCP2表达水平分别为(81.74±7.47)ng/L、2.31±0.31,均高于对照组[(5.35±1.32)ng/L、0.72±0.16],差异均有统计学意义(P<0.05)。绘制ROC曲线结果显示,GFAP、MeCP2、两者联合诊断脑胶质瘤的曲线下面积(AUC)分别为0.721、0.698、0.897。GFAP、MeCP2两者联合对脑胶质瘤的诊断AUC高于两者单一诊断。病理分级Ⅳ级、远处转移患者GFAP水平均高于其他分级、未远处转移,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理分级Ⅳ级、肿瘤大小≥3 cm、远处转移患者MeCP2水平均高于其他分级、肿瘤大小<3 cm、未远处转移患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关分析结果表明,GFAP与脑胶质瘤不同病理分级、远处转移均呈正相关(r=0.579、0.378,P<0.05);MeCP2与脑胶质瘤不同病理分级、远处转移、脑胶质瘤肿瘤大小均呈正相关(r=0.657、0.457、0.384,P<0.05)。结论胶质纤维酸性蛋白、甲基化CpG结合蛋白2对于脑胶质瘤均具有重要诊断参考价值,两者联合诊断敏感度、特异度更高,且两者与脑胶质瘤的病理分级、肿瘤大小、远处转移情况密切相关。

5-杂氮-2′-脱氧胞苷对宫颈癌细胞生长及其甲基化转移酶和甲基结合蛋白DNA转录的影响

目的:检测5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对体外培养的宫颈癌HeLa细胞中DNA甲基化转移酶(DNMT)及甲基CpG结合蛋白(MeCP)的DNA转录水平的影响,探索其对肿瘤细胞生长的抑制作用。方法:5-Aza-CdR(终浓度为5.0μmol.L-1)与肿瘤细胞共培养72h后,用PI染色及流式细胞仪(FCM)检测肿瘤细胞的细胞周期;利用qRT-PCR鉴定药物组与空白组细胞DNMT及MeCP的mRNA浓度。吖啶橙(AO)细胞荧光染色法鉴定药物组与空白组细胞形态学上的差异及凋亡的程度。结果:FCM检测结果显示两组肿瘤细胞的细胞周期呈现明显差异,并且药物组细胞表现为G0/G1期阻滞,sub-G1峰明显。AO染色表明药物组细胞有明显凋亡迹象且伴随少量的细胞坏死现象。qRT-PCR结果显示,空白对照组和药物组中均有一定量DNMT及MeCP的mRNA产物,但其mRNA表达量无显著差异(P>0.05)。结论:5-Aza-CdR能够诱导体外培养的HeLa肿瘤细胞凋亡,而对于肿瘤细胞中甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的DNA转录无显著的影响。

多发性骨髓瘤U266细胞株DNA甲基转移酶和甲基结合蛋白的表达

目的检测多发性骨髓瘤（MM）细胞DNA甲基转移酶（DNMTs）及甲基结合结构域（MBD）蛋白[包括甲基CpG结合结构域蛋白（MeCP2）和MBD2]的表达状况,探索其在基因甲基化过程的作用。并观察5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）和/或曲古霉素A（TSA）对DNMTs及MeCP2和MBD2的作用。方法利用荧光定量聚合酶链反应（PCR）分析MMU266细胞株DNMTs（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b）及MeCP2和MBD2蛋白的mRNA水平,与10名正常人单个核细胞（PBMC）mRNA比较。4μmol/L5-Aza-CdR和/或0.1μmol/LTSA与U266细胞共培养,分析MBD2和MeCP2蛋白mRNA的变化情况。WesternBlot检测这2种药物对U266细胞MBD2蛋白的影响。结果各甲基化调控蛋白mRNA与PBMCmRNA相比,差异有统计学意义（P均〈0.05）。其中DNMTs和MBD2蛋白在U266细胞中表达升高,而MeCP2蛋白表达下降。经5-Aza-CdR和/或TSA作用后,MBD2表达下降,MeCP2升高。5-Aza-CdR在蛋白水平对MBD2的作用亦不显著;TSA可明显降低MBD2的表达,且具有时间依赖性。结论 DNMTs和MBD2、MeCP2蛋白在MMU266细胞中表达异常,可能与U266细胞多个抑癌基因启动子高甲基化相关。5-Aza-CdR和TSA可以逆转U266细胞MBD2和MeCP2的表达。

DNA甲基结合蛋白2调节少突胶质前体细胞终末分化的作用及机制

目的探究DNA甲基结合蛋白(MeCP)2调节少突胶质前体细胞(OPCs)终末分化的作用及机制。方法 (1)采用Western印迹方法观察MeCP2沉默对OPCs分化成熟的影响;(2)运用甲基特异性聚合酶链反应(PCR)(BSP)和定量实时PCR(qRT-PCR)探究少突终末标志物内转录因子Sry相关Box17因子(SOX)10、DNA甲基结合蛋白(MBP)、髓鞘相关糖蛋白(MAG)、髓鞘脂蛋白(PLP)甲基化和表达变化。结果与正常细胞相比,在MeCP2沉默的OPCs中,与OPCs分化成熟相关2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶(CNP)重组蛋白表达明显上调,同时SOX10、MBP、MAG、PLP表达均明显上调;但呈现低甲基化水平。结论 MeCP2沉默可促进OPCs终末分化标志物的表达及甲基化水平的降低,从而促进OPCs成熟分化。

急性脑出血患者血清E盒锌指结合蛋白1及DNA甲基化转移酶1与神经功能缺损和预后的相关性分析

目的探讨急性脑出血(ACH)患者血清E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)、DNA甲基化转移酶1(DNMTl)与神经功能缺损、预后的关系。方法选取2019年7月—2022年7月本院收治的105例ACH患者为ACH组,依据ACH患者入院时美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分将其分为轻度组(n=34)、中度组(n=41)、重度组(n=30)。根据改良Rankin量表(mRS)评分将ACH患者分为预后良好组(n=65)和预后不良组(n=40)。另纳入同期105例体检健康者为对照组。选取2021年7月—2022年7月本院诊治的45例ACH患者对构建的ACH预后模型的受试者工作特征(ROC)曲线进行验证。采用酶联免疫吸附试验检测血清ZEB1、DNMT1水平;采用Spearman法分析ACH患者ZEB1、DNMT1水平与NIHSS评分的关系;采用多因素Logistic回归模型分析ACH患者预后的影响因素,采用ROC曲线评估血清ZEB1、DNMT1水平对ACH患者预后的预测价值。结果与对照组相比,ACH组血清ZEB1、DNMT1水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与轻度组相比,中度组和重度组ACH患者血清ZEB1、DNMT1、NIHSS评分均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与中度组相比,重度组ACH患者血清ZEB1、DNMT1、NIHSS评分均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman分析结果显示,ACH患者血清ZEB1、DNMT1水平与NIHSS评分均呈正相关(r=0.569、0.763,P均<0.001)。单因素分析结果显示,与预后良好组比较,预后不良组患者NIHSS评分、血肿体积、ZEB1及DNMT1水平均升高或增大,差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,ZEB1、DNMT1、NIHSS评分、血肿体积增大是ACH患者预后不良的危险因素(P<0.05)。血清ZEB1、DNMT1预测ACH患者预后的曲线下面积(AUC)分别为0.834、0.854,ZEB1、DNMT1联合预测ACH患者预后的AUC为0.944,灵敏度为95.0%,特异度为86.2%。以验证组人群对预测预后的ROC曲线进行验证,结果显示AUC为0.903(95%CI:0.854~0.951),提示预后预测曲线具有较好的区分度。结论ACH患者血清ZEB1、DNMT1水平较高,二者均与ACH患者神经功能缺损、预后显著相关,且血清ZEB1、DNMT1联合可能更有利于临床评估ACH患者预后情况。

甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)基因多态性与长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(SLE)的相关性

目的探讨甲基CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)基因单核苷酸多态性与中国长江以南汉族人群系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)的易感性。方法采用病例对照研究设计,收集病例141例,对照144例。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对rs2239464、rs2075596两位点进行基因分型,在不同的遗传模式下分析两个位点基因多态性与SLE的相关性。根据赤池信息准则(Akaike’s information criteria,AIC)值最小原则,筛选最优模型。结果在显性、隐性、相加及相乘遗传模式下,两位点基因型或等位基因频率分布在病例组与对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。显性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG/AG基因型为SLE的保护性基因型(ORrs2239464=0.528,95%CIrs2239464:0.315～0.885;ORrs2075596=0.435,95%CIrs2075596:0.264～0.717)。隐性遗传模式下,rs2239464、rs2075596位点GG基因型在统计学上具有显著的保护性作用(ORrs2239464=0.108,95%CIrs2239464:0.013～0.863;ORrs2075596=0.097,95%CIrs2075596:0.012～0.771)。相加遗传模式下,以AA基因型为参照,rs2239464位点GG基因型为SLE的保护性基因型(OR=0.094,95%CI:0.012～0.758),rs2075596位点AG及GG基因型也具有保护性作用(ORAG=0.498,95%CIAG:0.298～0.832;ORGG=0.077,95%CIGG:0.010～0.612)。相乘遗传模式下,rs2239464、rs2075596两位点的G等位基因为SLE的保护性等位基因(ORrs2239464=0.503,95%CIrs2239464:0.319～0.793;ORrs2075596=0.445,95%CIrs2075596:0.289～0.686)。rs2239464,rs2075596位点的最优遗传模式均为相加遗传模式。结论在中国长江以南汉族人群中MECP2基因rs2239464,rs2075596位点基因多态性与SLE相关,突变等位基因G可能是SLE保护性等位基因。

电磁脉冲辐照促进大鼠海马组织甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)表达并下调神经源素2(Ngn2)的表达

目的研究电磁脉冲(EMP)辐照后海马神经元形态、大鼠海马神经源素2(Ngn2)和甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)蛋白表达水平的改变。方法成年健康雄性SD大鼠随机分为对照组、EMP 7 d组、EMP 14 d组(n=12)。采用HE染色检测大鼠海马神经元的形态、Western blot法检测大鼠海马神经元Ngn2、MeCP2、脑源性神经营养因子(BDNF)、突触后致密蛋白95(PSD95)的蛋白水平,免疫荧光组织化学染色检测大鼠海马神经元MeCP2、Ngn2的表达。结果与对照组比较,EMP 7 d组和EMP 14 d组锥体细胞减少,神经元边界模糊,细胞核轮廓模糊不清。与EMP 7 d组相比,EMP 14 d组海马神经元结构破坏更严重;与对照组比较,EMP 14 d组和EMP 7 d组Ngn2、BDNF、PSD95含量降低,而MeCP2表达增加。结论EMP暴露导致大鼠海马组织神经元病理损伤,MeCP2表达增加,Ngn2、PSD95、BDNF表达降低。

miR-214-5p通过DNMT1介导的AXIN2基因DNA甲基化修饰在皮肤基底细胞癌中的作用机制

目的探讨皮肤基底细胞癌中轴抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因启动子甲基化对基因转录的影响及miR-214-5p通过靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)对AXIN2甲基化率的调控机制。方法收集2022年1月-2023年6月在广州市皮肤病防治所就诊治疗的102例皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)患者作为研究对象,提取癌组织和癌旁正常组织标本及基线资料。焦磷酸测序法检测AXIN2基因启动子区甲基化率。实时荧光定量PCR检测AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表达水平。将miR-214-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照(mimic NC和inhibitor NC)分别对基底细胞癌A431细胞进行转染,48 h后检测DNMT1基因mRNA表达水平和AXIN2基因甲基化率。结果BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率显著高于癌旁正常组织(t=5.128,P<0.001),AXIN2基因mRNA相对表达水平显著低于癌旁正常组织(t=7.826,P<0.001),DNMT1基因mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(t=4.838,P<0.001),miR-214-5p表达水平显著低于癌旁正常组织(t=5.426,P<0.001)。BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率与其mRNA表达水平呈负相关(r=-0.793,P<0.001),DNMT1基因mRNA水平与AXIN2基因甲基化率呈正相关(r=0.814,P<0.001),miR-214-5p表达水平与DNMT1基因mRNA水平呈负相关(r=-0.747,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。细胞转染后,与mimic NC、inhibitor和inhibitor NC比较,mimic的DNMT1基因mRNA水平、AXIN2基因甲基化率显著降低(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平和AXIN2基因甲基化率相较于其他三组明显上升(P<0.001)。结论miR-214-5p可通过调控下游靶蛋白DNMT1表达,影响AXIN2基因的DNA甲基化率,调控AXIN2基因的表达水平,参与皮肤基底细胞癌的发生机制。

基于MeCP2蛋白和双酶信号放大的DNA甲基化电化学免疫分析

目的:探讨甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)和双酶信号放大电化学免疫传感器用于DNA甲基化定量检测的效果。方法:固定在纳米金(AuNPs)修饰电极表面的探针与靶DNA杂交后,将电极于37 ℃下与MeCP2蛋白溶液孵育,再与葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)共同标记的MeCP2-His标签抗体(GOD-HRP/anti-His tag)反应;于含葡萄糖和对苯二酚的检测液中测试其电化学信号,建立电信号大小与DNA甲基化浓度之间的关系,确定该传感器的检测限,考察实验所设计的双酶信号放大策略的放大效果。结果:在1.0×10 -14 ~1.0×10 -7 mol/L范围内,电信号大小与DNA甲基化浓度的对数呈线性关系,回归方程为 I (峰电流值,μA)=1.038 lg C (DNA甲基化的浓度,mol/L)+16.598,相关系数 r 为0.993,检出限为0.1 fmol/L;双酶标记体系的DPV峰电流最高(9.105 μA),单独HRP标记体系的DPV峰电流为1.99 μA,单独GOD标记体系的电信号极其微弱、仅为0.969 μA;重复性实验得 RSD 为4.6%;将传感器置于pH 7.4的PBS中,4 ℃条件下放置28 d后,响应电流大小为最初的93.7%,表明该传感器具有较好的稳定性;与单酶标记体系相比,双酶标记体系产生的电化学信号更强。结论:采用基于MeCP2和双酶信号放大电化学免疫传感器具有较高的灵敏度,能实现痕量DNA甲基化的检测。

甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)遏制HEK293细胞甲基化修饰的IL-6启动子活性及其分子机制

目的 在HEK293细胞甲基化修饰白细胞介素6(IL-6)启动子序列并过表达甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)以及转录因子P300,探讨MeCP2抑制IL-6转录活性的分子机制。方法 通过电泳迁移率实验(EMSA)对P300 IL-6启动子区域的P300结合位点进行验证,IL-6启动子序列连接于荧光素酶报告质粒并转染HEK293细胞,同时利用规律间隔的成簇短回文重复序列-去活性Cas9核酸酶-DNA甲基转移酶3A(CRISPR-dCas9-DNMT3A)转染介导启动子的甲基化修饰,再转染MeCP2以及P300过表达质粒。亚硫酸氢盐测序PCR分析各组IL-6启动子区域胞嘧啶甲基化修饰情况;Western blot法检测胞内MeCP2、 P300蛋白水平;通过化学发光检测仪测定HEK293荧光素酶活性,并结合染色质免疫沉淀-测序技术(ChIP-seq)分析各组P300以及MeCP2在IL-6启动子区域的结合水平。结果 EMSA证实小鼠IL-6启动子部位存在P300结合位点;CRISPR-dCas9-DNMT3A转染HEK293细胞能够成功甲基化小鼠IL-6启动子;MeCP2以及P300过表达质粒能够稳定合成目标蛋白,且不受其他转染影响。相比于未被修饰的启动子,甲基化修饰可降低启动子转录活性,且于P300过表达情况下,较之单纯甲基化修饰,过表达MeCP2还将进一步遏制启动子转录活性。此外,甲基化修饰的启动子与MeCP2结合后,过表达P300未提升启动子转录活性;而在其他转染条件下,过表达P300均能促进转录活性。Chip-seq分析进一步表明,启动子的甲基化修饰并不干扰P300结合;然而甲基化修饰的启动子与MeCP2结合后,P300与启动子的结合则受到抑制。结论 MeCP2与甲基化修饰的IL-6启动子相结合,可阻遏转录因子与启动子结合,从而进一步抑制启动子的转录活性。

系统性红斑狼疮患者甲基-CpG结合蛋白2基因表达水平及其与DNA甲基化相关性的初步研究

系统性红斑狼疮(SLE)是一种病因未明的累及全身多器官的慢性进行性病谱性自身免疫病。表观遗传学研究显示,DNA低甲基化为解释SLE发病机制和开发新的治疗策略提供了新的线索。DNA低甲基化通过促进CD11a/CD18、CD70等共刺激分子的表达,使得T细胞具有自身反应性。

脑卒中患者TOAST、OCSP分型与外周血DNA甲基转移酶及MeCp2蛋白水平的关系

目的研究脑卒中患者治疗急性卒中实验(TOAST)、牛津郡社区卒中项目(OCSP)分型与外周血DNA甲基转移酶(Dnmt)1、Dnmt3a、Dnmt3b及甲基CpG结合蛋白(MeCp2)水平的关系。方法选取2017年2月至2020年5月该院收治的116例急性缺血性脑卒中患者作为观察组,另选取同期50例健康志愿者作为对照组,采集所有研究对象外周静脉血检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b及MeCp2水平,分析脑卒中患者外周血Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b及MeCp2水平与TOAST、OCSP分型及脑梗死面积的关系。结果观察组患者外周血Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b及MeCp2水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同TOAST分型患者外周血Dnmt3a、Dnmt3b及MeCp2水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);而外周血Dnmt1水平比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中大动脉粥样硬化型(LAA)组与不明原因型(SUE)组外周血Dnmt1水平均明显高于心源性栓塞型组、小动脉闭塞型组和其他明确病因型组,差异均有统计学意义(P<0.05);而LAA组与SUE组外周血Dnmt1水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。不同OCSP分型患者外周血Dnmt3b水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);而外周血Dnmt1、Dnmt3a及MeCp2水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中完全前循环梗死(TACI)组外周血Dnmt1、Dnmt3a及MeCp2水平与后循环梗死(POCI)组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);TACI组和POCI组外周血Dnmt1、Dnmt3a及MeCp2水平均明显高于部分前循环梗死组和腔隙性梗死组,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同梗死面积患者外周血Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b及MeCp2水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论缺血性脑卒中患者发病24 h内外周血Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b及MeCp2水平均异常升高,其表达水平与患者TOAST分型有关,而与患者脑梗死面积无关。

小鼠α2(Ⅰ)胶原基因DNA结合蛋白研究

目的 :初步分析小鼠α2 ( )胶原基因上游 5′- U TR近端 80 0 bp(- 780～ + 5 4bp)序列的 DNA结合蛋白。 方法 :PCR扩增小鼠α2 ( )胶原基因 - 2 5 8～ + 5 4bp,- 5 19～ - 2 48bp,- 741～ - 5 0 1bp片段 ,Dig- d U TP末端标记 PCR产物 ,与经 SDS- PAGE并转印至膜上的胶原产生细胞的核抽提物进行 DNA -蛋白质结合反应 ,以抗 Dig抗体检测结合反应信号。 结果 : 型胶原基因上游 5′- U TR近端 80 0 bp序列中存在至少 3个不同的核转录因子结合位点 ,相识别 (consensus)的核蛋白因子相对分子质量分别为 12万 ,5万 ,2万。TGF- β1可增强细胞中相对分子质量为 12万的核蛋白因子的表达。结论 :小鼠 α2( )胶原基因上游 - 780～ + 5 4bp这 80 0 bp片段中存在与不同的核蛋白因子结合的序列 ,可能与 Sp- 1有关。TGF- β1通过增强相对分子质量为 12万核蛋白的表达而促进该蛋白与靶调控序列的结合。

甲基化结合蛋白2对人胰腺癌PANC1细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨甲基化结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)对人胰腺癌PANC1细胞增殖和迁移能力的影响。方法:采用qRT-PCR和免疫印迹法检测MeCP2在PANC1、Pa Tu8988、SW1990 3种胰腺癌细胞株中的表达水平;将干扰质粒sh MeCP2(实验组)与对照质粒sh EGFP(对照组)分别转入PANC1细胞中,CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞迁移能力。结果:MeCP2在3种胰腺癌细胞中差异性表达。与对照组相比,实验组PANC1细胞中MeCP2 mRNA和蛋白表达明显降低(t分别为6.58,8.42,P均<0.05);细胞相对增殖率、细胞克隆形成数及迁移能力明显降低(P均<0.05)。结论:下调MeCP2表达可降低胰腺癌PANC1细胞的增殖和迁移能力。

甲基化CpG结合蛋白2参与缺血性卒中后基底节神经再生的分化调控

研究背景脑缺血可诱导非神经再生区(如基底节)神经再生和神经干细胞分化,但其调节机制尚不明确。本研究旨在探索缺血性卒中后基底节神经干细胞分化过程中可能的表观遗传学调控机制。方法采用Western blotting法检测表观遗传学调节因子甲基化结合蛋白2(MeCP2)及其磷酸化修饰形式pMeCP2在脑缺血大鼠基底节的表达变化,免疫组织化学染色观察MeCP2和pMeCP2阳性细胞形态特征,以及pMeCP2与神经干细胞标志物巢蛋白和神经元标志物微管相关蛋白2(MAP 2)的共定位情况。结果 (1)脑缺血后基底节MeCP2发生磷酸化形成pMeCP2,MeCP2阳性细胞数目减少(t=12.239,P=0.000)、pMeCP2阳性细胞数目增加(t=5.808,P=0.000)。(2)脑缺血后基底节神经细胞胞核MeCP2表达水平降低(t=14.949,P=0.000)、胞质pMeCP2表达水平升高(t=5.026,P=0.001)。(3)MeCP2磷酸化可介导MeCP2从细胞核转移至细胞质。(4)脑缺血第3天,pMeCP2可与神经干细胞标志物巢蛋白共存于同一细胞;第7天时,pMeCP2可与神经元标志物MAP 2共存于同一细胞。结论脑缺血损伤诱导的MeCP2磷酸化可以改变MeCP2空间分布特征,使其从细胞核转移至细胞质,并影响其生物学功能。本研究结果进一步提高了对成年动物脑组织神经再生的认识,为神经再生治疗神经退行性疾病和损伤性疾病提供了新的视角。

男性孤独症儿童甲基CpG结合蛋白-2基因突变的分析

目的:应用甲基CpG结合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)基因突变筛查方法,检测孤独症患者的MECP2基因,探讨孤独症与MECP2基因的关系。方法:收集男性孤独症44例,均满足孤独症《美国精神障碍诊断和统计手册》第4版诊断标准,应用变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)筛查MECP2基因变异,并进行DNA测序鉴定。对存在MECP2基因错义突变的病例进行家系调查。结果:在44例患者中经DHPLC筛查阳性和DNA测序发现,4例患者存在不同的MECP2基因突变,包括c.590C>T(T197M)和c.602C>T(A201V)2种错义突变,以及c.1053C>G、c.897C>T 2种同义突变;17例的内含子3位于Exon 4前74位点C>T,为SNP(rs2071569);1例c.602C>T错义突变患者家系调查发现,突变来源于母亲及外祖父,母亲呈杂合子,为X染色体随机失活,母亲与外祖父智力均正常,外祖父有抑郁症。结论:在男性孤独症患者中,存在MECP2基因较高的变异率,MECP2基因在孤独症致病中可能起着一定作用,不除外是孤独症的易感基因。

碳水化合物反应元件结合蛋白基因启动子甲基化与2型糖尿病的相关性研究

目的:针对2型糖尿病(T2DM)患者单核细胞之中糖类反应组件结合蛋白(ChREBP)进行分析,确定其基因启动子范围的甲基化程度,并分析其与T2DM之间的相关性。方法:空腹抽取研究目标的静脉血液,肝素进行处理,分析测试机检测其在空腹状态下的生化指标,通过针对甲基化的PCR亚硫酸氢盐限制性内切酶法(BSP)考察ChREBP的启动子甲基化程度均值。结果:T2DM组病人ChREBP基因启动子的甲基化程度均值在P<0.05的条件下较对照组更高;对于实验组,其ChREBP基因之中的8个CpG位点和对照组相比拥有更高的甲基化程度,且在P<0.01的条件下存在统计学上的显著差别。结论:2型糖尿病病人具有更高的ChREBP基因启动子甲基化程度,所以本研究针对ChREBP基因进行分析,考察其启动子CpG位点的甲基化程度,结果显示,该甲基化程度的不正常可能和糖尿病存在一定的相关性。

甲基化CpG结合结构蛋白2在胃癌的表达及靶向抑制

目的:研究甲基化CpG结合结构蛋白2(methyl-CpG-binding domain protein 2,MBD2)在胃癌的表达及靶向抑制。方法:免疫组化法对40例胃癌及配对胃黏膜组织,免疫荧光法对胃癌细胞SGC-7901行MBD2表达研究。构建3个靶向抑制MBD2的siRNA(MBD2-siRNA-1、MBD2-siRNA-2、MBD2-siRNA-3)。转染MBD2-siRNA入SGC-7901,RT-PCR及Western blot验证MBD2的抑制效果。噻唑蓝比色法检测SGC-7901增殖率。结果:胃癌组织MBD2表达较对照胃黏膜组织增强(χ2=6.646,P=0.010);且低分化胃癌与伴幽门螺杆菌感染的胃癌中MBD2表达更强(χ2值分别为9.730、8.700,P值分别为0.01和0.04)。MBD2蛋白在胃癌胞核分布。MBD2-siRNA可成功转染SGC-7901,并成功筛选靶向抑制MBD2的siRNA(MBD2-siRNA-2)。发现转染MBD2-siRNA-2后96 h,SGC-7901增值率被抑制。结论:MBD2在胃癌表达增强,抑制MBD2可能抑制胃癌增殖。