DNA甲基转移酶1缺乏通过改善胆固醇积累改善巨噬细胞运动和伤口愈合

目的皮肤伤口的愈合需要在损伤部位招募巨噬细胞,驱动巨噬细胞运动的机制尚不清楚。方法通过微吸管吸吮实验,发现巨噬细胞中Dnmt1的抑制可以消除LPS刺激的细胞弹性和黏弹性的变化。纳米压痕法测定的细胞刚度表明,LPS以dnmt1依赖的方式增加了胆固醇的细胞积累,胆固醇含量决定细胞刚度和运动性。脂质组学分析表明,Dnmt1抑制改变了细胞脂质稳态,并将抑制剂封装在热敏PF-127水凝胶中,将其作用于全层皮肤伤口探讨伤口愈合机制。结果和结论在这项研究中,骨髓特异性Dnmt1缺失增强了伤口修复。本研究发现,用LPS处理细胞增加了巨噬细胞的弹性模量k1(但没有k2)和黏性模量,表明细胞硬化的表型。LPS诱导的巨噬细胞硬化是由Dnmt1介导的。本研究验证了膜胆固醇含量和细胞刚度之间的相关性。通过使用经典的方法来增加或减少膜胆固醇,结果表明,添加胆固醇增加细胞硬度。本研究利用脂质组学分析定量研究胆固醇酯组分,有趣的是,与WT巨噬细胞相比,Dnmt1缺失降低了游离胆固醇含量,增加了胆固醇酯。此外,在热敏PF-127水凝胶中,avasimibe和probucol联合处理,可抑制Dnmt1KO小鼠的局部伤口愈合率。本研究揭示了Dnmt1依赖于巨噬细胞机械特性和相关趋化运动的表观遗传机制,表明Dnmt1既是疾病的标志,也是伤口愈合治疗干预的潜在靶点。

何首乌饮通过DNA甲基转移酶1延缓大鼠睾丸间质细胞衰老

目的探讨何首乌饮能否通过DNA甲基转移酶1(DNMT1)延缓大鼠睾丸间质细胞衰老。方法40只Wistar雄性大鼠随机分为4组,每组10只。免疫组织化学检测各组大鼠睾丸组织中DNMT1表达水平。ELISA实验检测各组大鼠血清中的睾酮含量。通过自由基氧化损伤建立大鼠睾丸间质细胞衰老模型。在睾丸间质细胞中使用慢病毒敲低DNMT1,通过β-半乳糖苷酶(β-GAL)染色、免疫荧光染色和ELISA实验检测细胞衰老状态和细胞上清液中睾酮和睾酮合成关键酶3β羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、细胞色素P450家族成员11A1(CYP11A1)的含量。结果与青年对照组相比,自然衰老组大鼠睾丸组织中P16蛋白表达和β-GAL阳性率明显升高,DNMT1表达和血清睾酮含量降低(P<0.05);何首乌饮干预能够降低衰老大鼠睾丸组织P16蛋白表达和β-GAL阳性率,提高DNMT1表达和血清中的睾酮含量(P<0.05)。衰老的睾丸间质细胞中呈现相同的趋势。在睾丸间质细胞中敲低DNMT1后,β-GAL阳性率和P16蛋白表达明显增加,睾丸间质细胞的睾酮分泌量和睾酮合成关键酶3β-HSD、CYP11A1含量明显减少,与正常组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。加入何首乌饮后,上述现象得到改善。结论何首乌饮可以通过DNMT1延缓大鼠睾丸间质细胞衰老。

miR-214-5p通过DNMT1介导的AXIN2基因DNA甲基化修饰在皮肤基底细胞癌中的作用机制

目的探讨皮肤基底细胞癌中轴抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因启动子甲基化对基因转录的影响及miR-214-5p通过靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)对AXIN2甲基化率的调控机制。方法收集2022年1月-2023年6月在广州市皮肤病防治所就诊治疗的102例皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)患者作为研究对象,提取癌组织和癌旁正常组织标本及基线资料。焦磷酸测序法检测AXIN2基因启动子区甲基化率。实时荧光定量PCR检测AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表达水平。将miR-214-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照(mimic NC和inhibitor NC)分别对基底细胞癌A431细胞进行转染,48 h后检测DNMT1基因mRNA表达水平和AXIN2基因甲基化率。结果BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率显著高于癌旁正常组织(t=5.128,P<0.001),AXIN2基因mRNA相对表达水平显著低于癌旁正常组织(t=7.826,P<0.001),DNMT1基因mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(t=4.838,P<0.001),miR-214-5p表达水平显著低于癌旁正常组织(t=5.426,P<0.001)。BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率与其mRNA表达水平呈负相关(r=-0.793,P<0.001),DNMT1基因mRNA水平与AXIN2基因甲基化率呈正相关(r=0.814,P<0.001),miR-214-5p表达水平与DNMT1基因mRNA水平呈负相关(r=-0.747,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。细胞转染后,与mimic NC、inhibitor和inhibitor NC比较,mimic的DNMT1基因mRNA水平、AXIN2基因甲基化率显著降低(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平和AXIN2基因甲基化率相较于其他三组明显上升(P<0.001)。结论miR-214-5p可通过调控下游靶蛋白DNMT1表达,影响AXIN2基因的DNA甲基化率,调控AXIN2基因的表达水平,参与皮肤基底细胞癌的发生机制。

急性脑出血患者血清E盒锌指结合蛋白1及DNA甲基化转移酶1与神经功能缺损和预后的相关性分析

目的探讨急性脑出血(ACH)患者血清E盒锌指结合蛋白1(ZEB1)、DNA甲基化转移酶1(DNMTl)与神经功能缺损、预后的关系。方法选取2019年7月—2022年7月本院收治的105例ACH患者为ACH组,依据ACH患者入院时美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分将其分为轻度组(n=34)、中度组(n=41)、重度组(n=30)。根据改良Rankin量表(mRS)评分将ACH患者分为预后良好组(n=65)和预后不良组(n=40)。另纳入同期105例体检健康者为对照组。选取2021年7月—2022年7月本院诊治的45例ACH患者对构建的ACH预后模型的受试者工作特征(ROC)曲线进行验证。采用酶联免疫吸附试验检测血清ZEB1、DNMT1水平;采用Spearman法分析ACH患者ZEB1、DNMT1水平与NIHSS评分的关系;采用多因素Logistic回归模型分析ACH患者预后的影响因素,采用ROC曲线评估血清ZEB1、DNMT1水平对ACH患者预后的预测价值。结果与对照组相比,ACH组血清ZEB1、DNMT1水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与轻度组相比,中度组和重度组ACH患者血清ZEB1、DNMT1、NIHSS评分均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与中度组相比,重度组ACH患者血清ZEB1、DNMT1、NIHSS评分均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman分析结果显示,ACH患者血清ZEB1、DNMT1水平与NIHSS评分均呈正相关(r=0.569、0.763,P均<0.001)。单因素分析结果显示,与预后良好组比较,预后不良组患者NIHSS评分、血肿体积、ZEB1及DNMT1水平均升高或增大,差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,ZEB1、DNMT1、NIHSS评分、血肿体积增大是ACH患者预后不良的危险因素(P<0.05)。血清ZEB1、DNMT1预测ACH患者预后的曲线下面积(AUC)分别为0.834、0.854,ZEB1、DNMT1联合预测ACH患者预后的AUC为0.944,灵敏度为95.0%,特异度为86.2%。以验证组人群对预测预后的ROC曲线进行验证,结果显示AUC为0.903(95%CI:0.854~0.951),提示预后预测曲线具有较好的区分度。结论ACH患者血清ZEB1、DNMT1水平较高,二者均与ACH患者神经功能缺损、预后显著相关,且血清ZEB1、DNMT1联合可能更有利于临床评估ACH患者预后情况。

甲基化转移酶SETDB1对口腔鳞状癌细胞迁移侵袭能力的影响及其机制

目的观察甲基化转移酶SETDB1对口腔鳞状癌细胞迁移、侵袭能力的影响,并探讨其相关机制。方法以不同浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8μmol/L)甲基化转移酶抑制剂GSK3685032作用于口腔鳞状癌细胞CAL-27,MTT法测算细胞增殖活力,筛选得到GSK3685032最佳作用浓度为0.6μmol/L。将CAL-27细胞分为对照组与实验组,对照组加入有机溶剂DMSO进行处理,实验组加入0.6μmol/L的GSK3685032处理。采用RT-qPCR法检测细胞SETDB1 mRNA,Western blotting法检测细胞SETDB1蛋白,细胞划痕实验观察细胞迁移能力,Transwell小室侵袭实验观察细胞侵袭能力,焦磷酸测序检测细胞内SOX7甲基化水平。结果实验组细胞SETDB1 mRNA及蛋白表达均低于对照组(P均<0.05);实验组细胞迁移距离小于对照组,穿膜细胞数少于对照组(P均<0.05);实验组细胞内SOX7甲基化率小于对照组(P<0.05)。结论甲基化转移酶SETDB1可抑制口腔鳞状癌细胞的迁移、侵袭能力,其机制可能与下调细胞内SOX7甲基化水平有关。

精氨酸甲基转移酶(PRMT)7通过IGF-1信号通路调控人骨髓间充质干细胞成脂分化的研究

目的本研究旨在明确精氨酸甲基转移酶(PRMT)7在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成脂分化过程中的变化以及是否调控hBMSCs成脂分化,进而探索相应的调控机制。方法通过定量反转录PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测hBMSCs成脂分化过程中PRMT7的变化;通过qRT-PCR和Western blot实验证明PRMT7稳定敲低细胞系构建成功。进行油红O染色和定量分析,以及qRT-PCR和Western blot实验检测PRMT7稳定敲低细胞系成脂分化水平的变化;通过裸鼠体内异位成脂实验,油红O染色检测PRMT7稳定敲低细胞系体内异位成脂的效果;通过qRT-PCR和Western blot证明PRMT7稳定过表达细胞系构建成功。进行油红O染色和定量分析以及qRT-PCR和Western blot实验检测PRMT7稳定过表达细胞系成脂分化水平的变化;通过q RT-PCR和Western blot实验检测敲低PRMT7和过表达PRMT7的细胞中IGF-1表达水平的变化。在PRMT7稳定敲低细胞系中转染siIGF-1并通过qRT-PCR和Western blot检测IGF-1的表达水平验证敲低效率。通过油红O染色和定量分析,qRT-PCR实验检测转染siIGF-1的敲低组hBMSCs成脂分化水平的变化。结果本文发现:在hBMSCs成脂过程中,PRMT7表达水平明显降低(P<0.01);敲低PRMT7后hBMSCs的成脂分化能力增强(P<0.001);敲低PRMT7后hBMSCs的体内异位成脂分化能力增强;过表达PRMT7后hBMSCs的成脂分化能力减弱(P<0.01);PRMT7敲低后IGF-1表达水平增加(P<0.0001);PRMT7过表达后IGF-1表达水平降低(P<0.0001);转染siIGF-1后,各细胞系IGF-1表达水平明显降低(P<0.001);敲低组转染siIGF-1后成脂分化能力明显降低(P<0.01)。结论本研究通过细胞水平和裸鼠皮下移植实验发现PRMT7显著抑制hBMSCs成脂分化,机制研究发现PRMT7对hBMSCs成脂分化的调控作用依赖IGF-1信号通路。上述研究表明,PRMT7可能是治疗相关疾病的潜在分子靶点,为PRMT7和hBMSCs应用于相关疾病治疗提供了新思路。

黄曲霉毒素B1诱导性大鼠肝癌超微结构观察及DNA甲基化转移酶3表达变化

由DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）活性改变诱导的DNA甲基化模式改变是肿瘤异常表观遗传修饰的重要机制,主要表现为基因组整体的低甲基化和区域性高甲基化,通过改变癌基因、抑癌基因的表达和基因组的稳定性,诱导正常细胞癌性转变[1-2]。DNMT3基因是DNMT家系重要成员,

宫颈癌组织中DNA甲基转移酶1mRNA的表达

目的:探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)在宫颈癌发生发展中的作用。方法:应用原位杂交技术检测52例宫颈癌、60例宫颈上皮内瘤变和20例正常宫颈组织DNMT1 mRNA的表达;分析DNMT1 mRNA的表达和宫颈癌患者临床病理指标的关系。结果:正常宫颈、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中DNMT1 mRNA的阳性率分别为10.0%(2/20)、63.3%(38/60)和78.8%(41/52),呈升高趋势(χ2=29.057,P<0.05),宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织DNMT1 mRNA的阳性率高于正常组织。不同宫颈癌的病理类型、临床分期、组织学分级及有无淋巴结转移组间DNMT1 mRNA阳性率差异无统计学意义。结论:DNMT1参与了宫颈癌的发生,并在宫颈上皮内瘤变时就已经起了重要作用。

杆状病毒介导的靶向DNA甲基转移酶1 siRNA表达载体的构建

目的:构建携带DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)RNAi基因的重组杆状病毒载体,以进一步研究DNMT1对胰腺癌相关基因的影响。方法:首先将带有BglⅡ和HindⅢ酶切黏性末端的60 bp正义和反义寡核苷酸退火,与用BglⅡ和HindⅢ双酶切后的线性化载体pSUPER连接构建成pSUPER si-DNMT1-D,然后将H1启动子和RNAi序列从上述重组载体切下,插入至同样双酶切的pFastBac1载体,经过转座重组,抽提重组BacmidDNA,转染草地贪夜蛾细胞Sf9,获得重组杆状病毒Bac-si-DNMT1-D。将上述重组杆状病毒感染胰腺癌PaTu8988细胞系,其中以重组杆状病毒r-Bac-CMV-EGFP作为阴性对照。然后运用荧光定量PCR检测DNMT1基因表达变化。结果:重组杆状病毒能够感染PaTu8988细胞,并且能显著干扰DNMT1基因表达。结论:杆状病毒表达系统可以作为RNAi载体,为以后的基因治疗开辟新的途径。

m^(7)G甲基转移酶1与泛癌预后及免疫浸润关联的初步分析

目的:探讨多种类型肿瘤中RNA m^(7)G甲基转移酶1(METTL1)表达规律及其与预后、免疫浸润的关联,以期为癌症生物标志物的筛选及其发生、发展机制提供新的参考依据。方法:运用癌症基因组图谱(TCGA)分析33种肿瘤中METTL1 mRNA表达谱及肿瘤组与正常对照组METTL1表达差异;Cox回归模型和Kaplan-Meier探讨METTL1表达与癌症患者预后的相关性;分析肝细胞癌(LIHC)中METTL1表达与免疫浸润的关联,并结合荧光定量PCR初步验证正常肝细胞和肝癌细胞中METTL1与免疫检查点的mRNA表达水平。结果:METTL1在癌组织和癌旁组织表达水平存在差异,在大多数癌组织中呈高表达;METTL1高表达显著缩短脑低级别胶质瘤(LGG)、LIHC和间皮瘤(MESO)患者中位生存时间;LIHC中METTL1表达与多种炎症细胞水平呈正相关关系,且METTL1表达水平与免疫检测点LAG3和PDCD1表达呈正相关关系(P<0.001),这与其在体外培养的肝癌细胞中mRNA表达水平一致。结论:METTL1显著促进大多数肿瘤的发生和进展,其负向调控LGG、LIHC以及MESO患者的预后生存率,并与免疫浸润呈正相关关系,有望作为基于LAG3和PDCD1免疫治疗的癌症生物标志物。

结直肠癌组织中DNA甲基转移酶-1和钠氢交换子调节因子1的表达、临床意义及相关性

目的探讨结直肠癌组织中DNA甲基转移酶-1(DNMT1)和钠氢交换子调节因子1(NHERF1)的表达、临床意义及相关性。方法选取2017年2月~2018年2月河北北方学院附属第一医院手术切除的结直肠癌(癌组)和癌旁正常组织(正常组)各50例,应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测两组DNMT1 mRNA和NHERF1 mRNA的表达,应用免疫组化(IHC)法检测两组DNMT1和NHERF1蛋白的表达,同时收集患者的临床资料,分析二者的表达与临床病理特征间的关系,应用Spearman检验分析两种蛋白间的相关性。结果qRT-PCR法结果显示:癌组中DNMT1 mRNA的表达水平明显高于正常组,而癌组中NHERF1 mRNA的表达水平则明显低于正常组,差异均有高度统计学意义(均P<0.01);IHC法结果显示:癌组中DNMT1蛋白阳性表达率明显高于正常组,而癌组中NHERF1蛋白阳性表达率明显低于正常组,差异均有高度统计学意义(均P<0.01);癌组中DNMT1和NHERF1蛋白的表达水平均与病变浸润程度、TNM分期、淋巴结转移及肝转移有关(均P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤大小和分化程度无关(均P>0.05);Spearman相关分析显示:癌组织中DNMT1与NHERF1呈负相关(r=-0.491,P<0.01)。结论DNMT1高表达和NHERF1低表达在结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用,二者均可作为结直肠癌早期诊断和治疗监测的潜在分子生物学指标。

死亡相关蛋白激酶1、KLF4、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶甲基化状态检测及与宫颈癌人乳头瘤病毒16感染的关系

目的检测宫颈癌组织死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)、KLF4、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子区域甲基化状态,初步探讨其甲基化状态与宫颈癌人乳头瘤病毒16(HPV16)感染的关系。方法选取宫颈癌患者103例为宫颈癌组,另选取同期年龄相匹配的慢性子宫颈炎患者110例为对照组。检测2组宫颈脱落组织DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化状态。通过人乳头瘤病毒检测HPV16感染情况,分析宫颈癌组织DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化与HPV16感染相关性。结果与对照组相比,宫颈癌组患者HPV16感染阳性率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,宫颈癌组DAPK1、KLF4、MGMT基因异常甲基化率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。分化程度低、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移及有远处转移患者宫颈癌组织DAPK1、KLF4、MGMT甲基化率高于分化程度高、中及TNM分期Ⅰ~Ⅱ、无淋巴结转移、无远处转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。与HPV16感染阴性相比,HPV16感染阳性患者中APK1、KLF4、MGMT甲基化比例升高,差异有统计学意义(P<0.05)。HPV16感染情况与APK1、KLF4、MGMT甲基化相关(r=0.454,0.497,0.307,P<0.05)。结论HPV16感染可能与APK1、KLF4、MGMT甲基化有关,HPV16感染可能通过影响APK1、RAR-β、MGMT基因甲基化促进宫颈癌的发展。

DNA甲基转移酶1和组蛋白去乙酰化酶1在子宫内膜异位症在位内膜的表达

目的探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)和组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)在子宫内膜异位症患者子宫内膜中的表达及其两者在子宫内膜异位症发生、发展中的作用。方法选取子宫内膜异位症患者在位内膜18例,无子宫内膜异位症的对照子宫内膜20例,应用免疫组织化学法测定DNMT1的分布,应用免疫印迹法检测内膜组织中DNMT1和HDAC1蛋白的表达。结果免疫组织化学提示,DNMT1主要分布于子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的胞核;子宫内膜异位症在位内膜中DNMT1的表达强度显著高于对照组子宫内膜(P<0.01)。免疫印迹发现,子宫内膜异位症在位内膜DNMT1和HDAC1蛋白的表达高于对照组子宫内膜,差异有统计学意义(P<0.05);且两者的表达呈正相关(P<0.05)。结论 DNMT1和HDAC1在EMs患者的高表达可能在子宫内膜异位症的发生、发展中起着重要作用。

血清DNA甲基转移酶1、DNA甲基转移酶3a在宫颈癌及癌前病变中的表达及与人乳头瘤病毒感染的相关性

目的检测宫颈癌及癌前病变病人血清中DNA甲基转移酶1(DNMT1)、DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)表达水平,探讨二者与人乳头瘤病毒(HPV)感染的相关性。方法选取2017年9月至2019年9月于焦煤集团中央医院收治住院的宫颈癌病人58例及癌前病变病人70例作为观察组。选取同期入院体检的正常女性志愿者50例作为对照组。采用酶联免疫吸附(ELI⁃SA)法检测血清中DNMT1、DNMT3a表达水平,检测各组HPV感染情况,将观察组根据是否感染HPV分为HPV感染组和HPV未感染组,比较两组间血清DNMT1、DNMT3a表达水平。分析血清DNMT1、DNMT3a水平与宫颈癌及癌前病变组病人病情严重程度及HPV感染类型的关系。结果宫颈癌及癌前病变病人血清DNMT1[(44.72±9.36)μg/L、(26.78±5.84)μg/L比(13.03±2.65)μg/L]、DNMT3a[(607.48±125.19)μg/L、(415.03±82.56)μg/L比(346.12±67.34)μg/L]表达显著高于对照组(P<0.05),宫颈癌病人血清DNMT1、DNMT3a表达显著高于癌前病变组(P<0.05)。血清DNMT1、DNMT3a水平与宫颈癌病人FIGO分期、CIN分级、HPV危险程度均相关(P<0.05)。血清DNMT1、DNMT3a诊断宫颈癌的AUC分别为0.918、0.875,截断值分别为36.049μg/L、563.431μg/L,特异性分别为92.9%、94.3%,敏感度分别为82.8%、70.7%;二者联合诊断宫颈癌的AUC为0.960,特异性为94.3%,敏感度为91.4%。各组HPV感染情况结果显示,宫颈癌组病人HPV阳性率最高为100.00%,宫颈癌前病变组HPV阳性率为61.43%,对照组HPV阳性率为6.00%,三组HPV感染情况差异有统计学意义(P<0.05)。HPV感染组病人及健康女性血清DNMT1、DNMT3a表达水平高于HPV未感染组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论宫颈癌及癌前病变病人血清DNMT1、DN⁃MT3a呈高表达,宫颈癌病人HPV感染率显著高于癌前病变病人,HPV感染病人血清DNMT1、DNMT3a表达水平升高,且高表达DNMT1、DNMT3a水平与宫颈癌及癌前病变病人病情严重、HPV感染高危相关。

DNA甲基转移酶1蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义

目的:研究DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)在膀胱移行细胞癌(transitional cell carcinoma of the bladder,TCCB)组织中的表达及其与肿瘤生物学行为的关系。方法:应用免疫组织化学SP法检测60例TCCB组织中DNMT1的表达,结合临床资料,分析其与肿瘤生物学行为的相关性。结果:TCCB组织中DNMT1阳性表达率为(86.7%,52/60),明显高于癌旁组织(43.3%,26/60)及正常膀胱组织(33.3%,5/15)(P<0.01);DNMT1蛋白的阳性表达率与肿瘤分化程度和性别呈一定的相关性(P<0.01),与TCCB患者的年龄和临床分期无明显相关性(P>0.05)。结论:DNMT1蛋白过表达在人TCCB的发生和发展中起一定作用。

DNA甲基转移酶1与CD11a基因在系统性红斑狼疮患者中mRNA水平的表达

目的检测系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者中DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)和CD11a基因的表达水平,探讨DNMT1的表达异常在SLE发病中的作用。方法用Real-time PCR方法测定SLE患者缓解期、活动期和正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中DNMT1和CD11a基因的表达水平。结果 SLE活动期患者PBMC中DNMT1的表达水平较对照组(P=0.014)和缓解期组(P=0.030)显著下降;缓解期的DNMT1表达水平与对照组(P=0.264)相比差异无统计学意义;SLE患者DNMT1的表达水平与SLE疾病活动指数(SLE disease activity index,SLEDAI)呈现负相关(P<0.05)。SLE活动期患者PBMC中CD11a的表达水平较对照组(P=0.003)显著升高(P<0.05);缓解期的CD11a表达水平与对照组(P=0.250)和缓解期组(P=0.069)相比差异无统计学意义(P>0.05);SLE患者CD11a的表达水平与SLEDAI呈正相关(P<0.05)。SLE患者DNMT1与CD11a的表达水平无显著相关性(P>0.05)。结论 SLE患者PBMC中DNMT1表达水平的降低可能是造成基因组DNA低甲基化的重要原因,使得CD11a等致病基因过度表达,进而导致SLE发病。

宫颈癌组织中DNA甲基转移酶1、3A和3B mRNA的表达

目的探讨DNA甲基转移酶1、3A和3B在宫颈癌发生发展中的作用。方法应用real-time PCR技术检测10例宫颈癌、10例宫颈上皮内瘤变和10例正常宫颈组织DNMT1、3A和3BmRNA的表达。结果宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 1mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.30±0.1、0.26±0.12和0.10±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 1表达有显著差异(P<0.05);宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT3A mRNA对GAPDH mRNA的相对丰度值分别是0.94±0.27、0.51±0.24和0.13±0.04,三组相比较有显著性差异(P<0.05);宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈中DNMT 3B mRNA对GAPDH mR-NA的相对丰度值分别是0.30±0.09、0.28±0.11和0.11±0.04,宫颈癌组织组织中与正常宫颈中DNMT 3B表达有显著差异(P<0.05)。结论 DNMT1、3A和3B参与了宫颈癌的发生,并在宫颈上皮内瘤变时就已经起了一定作用。

靶向DNA甲基转移酶1的siRNA表达载体的构建与筛选

目的:构建针对DNA甲基转移酶(dnmt1)基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)表达载体,以用于后续的RNA干扰研究。方法:针对人dnmt1的mRNA序列,设计并合成6条编码siRNA的寡核苷酸片段,经退火成互补双链,克隆至载体pSilencer3.1-H1中构建3个重组体,分别命名为pshRNA-dnmt1-A、pshRNA-dnmt1-B和pshRNA-dnmt1-C,并进行测序鉴定。再利用无内毒素的大提质粒试剂盒制备无内毒素的pshRNA-dnmt1-A、B和C,分别通过脂质体介导转染宫颈癌HeLa细胞,以未转染和转染空载体者为对照。采用RT-PCR和Western blot检测转染细胞dnmt1 mRNA及蛋白表达情况。结果:成功构建了表达靶向dnmt1的siRNA重组载体;转染pshRNA-dnmt1-C对HeLa细胞dnmt1基因的表达几乎无影响。pshRNA-dnmt1-A、B均能有效沉默HeLa细胞中dn-mt1基因的表达,其dnmt1mRNA表达的抑制率分别为21.8%和69.7%,蛋白表达的抑制率分别为27.9%和73.2%,以pshRNA-dnmt1-B的干扰效果最佳。结论:成功构建并筛选出了有效的dnmt1siRNA表达载体。

DNA甲基转移酶1在子宫颈癌组织和细胞中的表达及意义

目的研究DNA甲基转移酶1(DNMT1)在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中的表达情况,分析其表达率与宫颈癌临床病理因素之间的关系,并探讨其在宫颈癌发生发展过程中的作用。方法采用免疫组化SP法检测DNMT1蛋白在3株宫颈癌细胞系(SiHa、Hela、C33A细胞系)及89例宫颈癌组织、20例宫颈上皮内瘤变(CIN)、20例正常宫颈上皮组织石蜡标本中的阳性细胞表达率,并分析其与宫颈癌临床病理因素之间的关系;用RT-PCR方法检测DNMT1 mRNA在3株宫颈癌细胞系及35例宫颈癌组织、24例CIN、20例正常宫颈组织新鲜标本中的表达情况。结果DNMT1蛋白在3株宫颈癌细胞中均有表达,而在对照组(人子宫内膜间质细胞)中无表达,在宫颈癌组织中的阳性表达率为71.9%,高于CIN组织(35.0%,P<0.05)和正常宫颈组织(10.0%,P<0.05);DNMT1蛋白的异常表达与宫颈癌组织的分化程度有关(P<0.05),与年龄、肿瘤病理型别、有无淋巴结转移和临床分期无明显关系。DNMT1 mRNA在3株宫颈癌细胞中均有表达,对照组细胞中无表达,在宫颈癌组织中的阳性表达率为85.7%,高于CIN组织(33.3%,P<0.05)和正常宫颈组织(5.0%,P<0.05)。结论DNMT1 mRNA和蛋白在宫颈癌组织和细胞中的阳性表达率均高于正常宫颈组织,有可能作为宫颈癌早期诊断的标志物。

siRNA沉默膀胱癌T24细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的研究

目的研究siRNA对膀胱癌细胞T24 DNA甲基转移酶1(DNMT1)表达的沉默作用。方法将筛选出的siRNA转染入膀胱癌T24细胞分为空白组、脂质体组、阴性对照组和siRNA组,分别运用RT-PCR、Western blot检测转染后不同时段DNMT1 mRNA水平、蛋白水平变化。结果筛选出的siRNA转染膀胱癌T24细胞DNMT1 24h开始出现mRNA减少,24h、48h、72h分别降至(66.05±4.87)%、(39.36±4.53)%和(40.86±4.81)%(P<0.05)。转染后24h、48h、72h蛋白水平分别降至(90.21±3.68)%、(71.45±3.44)%和(67.74±3.38)%(P<0.05)。结论 siRNA能有效地沉默膀胱癌细胞T24 DNMT1的表达。