具有修复功能的尿嘧啶-DNA糖苷酶

具有修复功能的尿嘧啶－ＤＮＡ糖苷酶刘丽贲昆龙（中国科学院昆明动物研究所免疫学实验室，昆明６５０２２３）关键词尿嘧啶－ＤＮＡ糖苷酶尿嘧啶ＤＮＡ修复在真核或原核生物中，尿嘧啶都不是正常ＤＮＡ的组分。但是，在下列两种情形下，尿嘧啶会成为ＤＮＡ的成分；①当细...

含有尿嘧啶DNA糖苷酶基因表达载体的构建

采用自行设计的带酶切位点的上下游引物，用PCR技术，从大肠杆菌ATCC23743的DNA中，获得了含有编码尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG）基因的PCR产物，以该PCR产物构建了重组克隆质粒PGEM／UNG，DNA序列分析结果确证其中含有完整的UNG基因．利用该重组质粒，进一步构建了重组表达质料pBV／UNG．

胸腺嘧啶DNA糖苷酶的研究进展

胸腺嘧啶DNA糖苷酶(Thymine DNA Glyco-sylase,TDG)作为一种DNA糖苷酶,其在DNA碱基切除修复(Base excision repair,BER)中的作用已引起大家的关注,同时,最近研究指出TDG还与转录因子、转录共激活因子及DNA甲基转移酶等相互作用,敲除TDG后可导致胚胎小鼠死亡,这提示TDG与基因调控、生长发育有关。此外,TDG能调节5氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的细胞毒性,可用于评估5-FU的化疗效果。最近的研究分析TDG在多种肿瘤组织中表达,与肿瘤的发生和发展有密切关系,提示TDG具有更多的基础医学和临床医学研究价值。

尿嘧啶DNA糖苷酶活性的电泳凝胶成像分析测定

尿嘧啶DNA糖苷酶(UNG)是防止PCR假阳性反应的工具酶,参照限制性DNA内切酶活力测定法的原理(以完全消化DNA带型的最高稀释度为一个活性单位)和应用凝胶成像分析技术,建立了UNG酶活性的非同位素检测新方法.反应体积为20μL,底物dU ung(dU DNA)为165μg,加UNG后在适当温度下反应10min,使底物去除尿嘧啶,其AP位点经碱降解.通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析,测定底物dU ung的残留量以测定UNG酶活性.酶活力以37℃每分钟降解1ngdU ung的酶量为一个单位,检测灵敏度为1ng,检测线性范围为0～165ng.该法简便易行、客观、精密,重复性好(CV<3%),结果显示直观.

尿嘧啶DNA糖苷酶防止PCR产物污染及其对核酸杂交的影响

目的 采用PCR微板核酸杂交ELISA技术分析尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG/UDG）防止PCR产物污染及其对PCR扩增效率的影响，探讨在不同A/T含量的微生物中含尿嘧啶的PCR产物对核酸杂交的影响。方法 以3组dUTP含量不同的PCR产物作模板，抗污染组用UNG处理，直接进行再次扩增。用微板核酸杂交ELISA检测第二次PCR扩增的结果。 结果 抗污染组中以含dUTP的PCR产物作模板，结果为阴性；而以不含dUTP的PCR产物作模板，结果为阳性。非抗污染组全部为阳性。对3组PCR产物再进行核酸杂交无明显差别，且在一定温度内，3组具有同样的稳定性。 结论 UNG能有效降解含dUTP的PCR产物，使之不能作为模板再次扩增，可以有效地防止PCR产物的污染。含有尿嘧啶的PCR产物对寡核苷酸探针的杂交无影响。

过表达尿嘧啶DNA糖苷酶2(UNG2)可增强HepG2细胞的抗氧化作用

目的检测尿嘧啶DNA糖苷酶2(UNG2)的糖苷酶活性,研究UNG2在肝癌细胞HepG2抗氧化损伤过程中的作用。方法构建UNG2的过表达载体,利用Western blot法检测UNG2过表达效果。在HepG2细胞过表达UNG2,免疫荧光细胞化学染色观察UNG2在细胞中的表达和定位,利用含脱氧尿苷的寡核苷酸为底物测定UNG2的DNA糖苷酶活性,利用H_2O_2毒性实验研究UNG2在HepG2肝癌细胞抗氧化存活中的作用。结果在HEK293FT细胞中成功表达了UNG2,并发现UNG2主要定位在HepG2细胞核中。酶活性实验表明UNG2可以有效地切割寡核苷酸中的脱氧尿苷位点。H_2O_2毒性实验表明过表达UNG2可以显著提高HepG2肝癌细胞在H_2O_2处理后的存活率。结论 UNG2具有特异的尿嘧啶糖苷酶活性,并且UNG2能够保护HepG2肝癌细胞抵抗氧化应激损伤。

人8羟-基鸟嘌呤DNA糖苷酶1基因低表达增加肺腺癌细胞对博来霉素的敏感性

目的研究DNA碱基切除修复基因人8羟-基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(hOGG1)低表达增加肺腺癌细胞对博来霉素(BLM)的敏感性的作用,为化疗增敏提供更多的实验依据。方法以肺腺癌A549细胞和通过稳定转染hOGG1核酶而获得的hOGG1低表达的A549-R细胞为研究对象,用MTT试验和集落形成抑制试验测定不同浓度BLM处理后两种细胞的存活率和形成集落的能力;体外微核试验及单细胞凝胶电泳检测两种细胞微核率及DNA损伤与修复的差异。结果BLM作用下A549-R细胞的IC50及集落形成率显著低于A549细胞;BLM可诱导两种细胞的微核率增高,而在相同浓度下A549-R细胞微核率较A549细胞更高;单细胞凝胶电泳结果显示,BLM作用下两种细胞均有不同程度DNA损伤,A549-R细胞的拖尾率和DNA迁移长度显著大于A549细胞;损伤后A549细胞修复发生较A549-R早,与A549细胞相比A549-R细胞更不易修复。结论hOGG1低表达使肺腺癌细胞DNA修复能力降低,从而使其对BLM的敏感性增强。

砷暴露致人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1基因甲基化及DNA氧化损伤

目的了解人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(hOGG1)基因DNA甲基化水平和机体氧化应激及DNA氧化损伤情况与砷中毒的关系。方法以贵州省兴仁县燃煤型砷中毒病区207名砷暴露者为砷暴露组(包括病区非患者46名、砷中毒轻度46名、中度60名、重度组55名),在非砷暴露村选择64名健康村民作为对照组。采集观察对象的外周血,应用甲基化特异性PCR(MSP)法检测其hOGG1基因甲基化水平,化学法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、丙二醛(MDA)含量,尿8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)含量;依据甲基化状态将上述观察对象分为hOGG1基因甲基化组(34名)和hOGG1基因非甲基化组(237名),分析其hOGG1基因DNA甲基化及氧化应激与砷中毒的关系。结果病区非患者、轻、中、重度砷中毒组砷暴露者外周血中hOGG1基因甲基化阳性率分别为4.35,13.04,15.00和29.09%,其显著高于对照组人群外周血中hOGG1基因甲基化阳性率1.56%,且hOGG1基因甲基化阳性率随着砷中毒程度的加重而增加;hOGG1基因甲基化组的血清SOD〔(85±25)kU·L-1〕、GSH-Px〔(70±26)kU·L-1〕活力、尿8-OHdG含量〔(22.5±6.8)μg·L-1〕明显低于非甲基化组〔118±41,171±56和(28±6.5)μg·L-1〕,hOGG1基因甲基化组与非甲基化组血清MDA含量无显著性差异。结论砷暴露可导致人机体hOGG1基因高甲基化和氧化与抗氧化系统失衡,从而引起DNA氧化损伤,是促进砷中毒发生发展的原因之一。

阳江高本底地区居民8-羟基脱氧鸟苷及其修复基因8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶表达水平

目的探讨小剂量长期连续天然放射性照射人群的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)及其修复基因8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(hOGG1)表达水平。方法选择我国阳江天然放射性高本底辐射地区(HBRA)50名50～59岁男性居民为研究对象,另选择在恩平市某镇(CA)出生并居住,年龄相仿的50名男性居民为对照人群。采集周围血10 ml,分离血浆和白细胞,酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血浆中DNA氧化损伤指标8-OHdG的水平,实时定量基因扩增荧光检测系统测定白细胞中DNA氧化损伤修复基因hOGG1 mRNA相对表达水平。结果与CA组比较,HBRA组人群周围血血浆中DNA氧化损伤指标8-OHdG水平较低,白细胞中hOGG1基因mRNA的相对表达水平较高,以上指标在2组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。结论小剂量长期连续照射可能会提高机体DNA氧化损伤修复能力。

嗜酸嗜热古菌Sulfolobus acidocaldarius编码尿嘧啶DNA糖苷酶表达,纯化与酶学特征

【目的】嗜高温微生物面临d C脱氨基生成d U损伤的巨大压力,鉴定嗜酸嗜热古菌S.acidocaldarius来源的尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)切除d U损伤的酶学活性。【方法】重组表达来源于S.acidocaldarius的IV和V型UDG,经亲和纯化得到电泳纯重组蛋白。然后利用人工合成的d U(deoxyuracil)修饰寡核苷酸片段作为底物,体外鉴定两种重组UDG的酶学特性。【结果】来源于S.acidocaldarius的IV和V型重组UDG具有相似的酶学特性。IV型UDG催化效率更高,比活性是V型重组UDG的750倍左右。作为来自嗜热微生物的蛋白,S.acidocaldarius的IV和V型UDG的最适反应温度为65-75℃。【结论】IV型UDG比V型UDG水解d U碱基和脱氧核糖之间糖苷键的能力更强。

DNA损伤修复基因8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)的研究进展

DNA分子对活性氧特别敏感,易受到活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）攻击,发生氧化性DNA损伤,促进癌症发生[1-2]。DNA分子主要氧化产物8-氧-鸟嘌呤（8-oxo-7,8-dihydroguanine,8-oxo-Gua）被视为DNA氧化损伤的生物标志物。

人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1与肺癌

人8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1（hOGG1）功能异常与肺癌等癌症发生发展密切相关,hOGG1基因多态性可能会改变酶的活性,从而影响个体损伤DNA的修复能力,促进癌变.hOGG1等DNA修复基因单核苷酸多态性联合效应提高人群肺癌的易感性.hOGG1参与调节肿瘤细胞的线粒体呼吸功能并影响肿瘤细胞生长.

火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶基因克隆、表达纯化和酶学性质研究

【目的】在大肠杆菌中表达火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,纯化得到重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,在此基础上系统研究火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶学特征。【方法】构建8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶重组表达质粒,将重组质粒转化Escherichia coli Rosetta(DE3),利用IPTG诱导表达重组蛋白,通过Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白;最后利用含8-氧鸟嘌呤损伤的寡核苷酸作为底物,测定8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶学性质。【结果】在大肠杆菌中成功诱导表达了重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,经Ni2+亲和纯化后蛋白纯度大于95%。在体外鉴定了重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶学性质。结果表明重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶可以切除DNA中的8-氧鸟嘌呤(8-Oxo-G,GO)损伤碱基,并且具有AP裂解酶活性。重组火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶催化反应的最适pH值和温度分别是pH 8.5和55°C。除Zn2+对火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶的酶促反应有明显的抑制作用外,实验中测定的其它二价离子(Mn2+,Mg2+,Ca2+,Ni2+,Co2+,Cu2+)对其没有明显的影响。离子强度在50-100 mmol/L范围内对其酶促反应影响不大,超过100 mmol/L时有明显的抑制作用。与8-氧鸟嘌呤互补的碱基差异对火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶切除8-氧鸟嘌呤损伤的效率影响不大;但与单链DNA相比,双链DNA是优选底物,切割效率如下:GO/C≈GO/G≈GO/T≈GO/A>GO/-。【结论】在大肠杆菌中成功表达,并Ni2+亲和纯化了火球菌8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶,生化研究表明制备的重组蛋白具有8-氧鸟嘌呤DNA糖苷酶活性,可能负责切除火球菌基因组DNA中的8-氧鸟嘌呤损伤。

一种来源于大菱鲆的热敏型尿嘧啶DNA糖苷酶的克隆表达及酶学性质鉴定

目的尿嘧啶DNA糖苷酶UDGase是一种广泛应用于qPCR、二代测序等领域的工具酶,由于其应用特性,只有热敏性UDGase才具有较大开发利用潜力。目前全球热敏性UDGase工具酶仅有2个物种来源,均有专利保护且价格昂贵,亟待开发新来源且具有优良热敏特性的UDGase。方法根据前人研究及序列分析推测大菱鲆(Scophthalmus maximus)具有热敏性UDGase。经验证,大菱鲆肝脏匀浆呈现UDGase活性。从大菱鲆肝脏匀浆克隆得到大菱鲆UDGase基因SmUDGase,并使用大肠杆菌工程菌株实现重组表达,分离纯化后进行活力表征检测。结果序列比对结果表明,SmUDGase基因克隆成功。重组表达并经亲和层析、离子交换层析分离纯化,获得纯酶纯度约95%,产率1.51mg/L,比活力2295.08U/mg。SmUDGase具有热敏性,在40℃时酶活即开始迅速降低。其他酶学性质,如pH适应范围、金属离子依赖性和对抑制剂的敏感性均与当前商业化UDGase一致。结论成功克隆并鉴定来自大菱鲆的新来源SmUDGase,该酶具有热敏感性,酶学特性接近目前商业化UDGase。并探索该酶的重组表达和纯化工艺,所得纯酶基本达到商业化生产水平,为该类型生物工具酶的开发提供了理论参考和技术储备。

极端嗜热古菌尿嘧啶DNA糖苷酶的研究进展

高温会加快碱基脱氨基反应形成损伤碱基的速率,进一步对脱氨基的碱基进行复制会导致突变。因此,极端嗜热古菌基因组的稳定性面临着其生存高温环境的挑战。胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶,是常见的脱碱基类型,复制DNA中尿嘧啶会造成GC→AT的突变。尿嘧啶DNA糖苷酶(Uracil DNA glycosylase,UDG)是修复DNA中尿嘧啶的关键酶。基于识别底物的特异性,UDG分为6个家族,广泛分布在细菌、古菌、真核生物以及一些病毒中。基因组序列显示,极端嗜热古菌至少编码一种UDG。目前,对于细菌和真核生物的UDG已进行了大量的研究,但是关于极端嗜热古菌UDG的研究相对较少,尚处于初期阶段。本文综述了极端嗜热古菌UDG的研究进展,并对今后的研究提出了展望。

极端嗜热古菌8oxoG DNA糖苷酶的研究进展

7,8二氢-8-氧鸟嘌呤(7,8-dihydro-8-oxoguanine,8oxoG)是一种常见的DNA损伤碱基。由于8oxoG能够与腺嘌呤配对,在DNA中的8oxoG被修复之前进行复制,DNA将会产生GC→TA的突变,从而造成基因组的不稳定。目前,碱基切除修复(Base excision repair,BER)是修复DNA中8oxoG的经典途径,其中8oxoGDNA糖苷酶(8-oxoguanineDNAglycosylases,OGG)是启动BER途径的关键酶。研究发现,OGG能够识别和切除DNA中的8oxoG,从而阻止细胞内GC→TA突变的积累。目前,OGG分为3个家族:OGG1、OGG2和AGOG (archaeal 8oxoG DNA glycosylase),广泛分布于细菌、古菌和真核生物。古菌基因组的序列表明,它们至少编码一种OGG。目前,对源自细菌和真核生物的OGG已进行了大量的研究,但是关于极端嗜热古菌OGG的研究相对较少,尚处于初期阶段。本文综述了极端嗜热古菌OGG的研究进展,并对今后的研究提出了展望。

8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶与支气管哮喘关系的研究进展

支气管哮喘(哮喘)是一种变态反应性疾病,其主要特征为气道高反应性和慢性气道炎症。8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1)是一个碱基切除DNA修复酶,OGG1可能在哮喘发作期间影响氧化应激和促炎因子的表达水平。OGG1可能直接或间接的在哮喘发病机制中发挥重要作用。本文主要介绍OGG1在哮喘发病中的作用及其可能机制,为寻找哮喘治疗新靶点奠定基础。

DNA氧化损伤及其修复基因OGG1和MTH1的研究进展

过量的自由基特别是活性氧自由基(ROS),可以攻击包括DNA、蛋白质等所有生物分子,产生多种不同氧化产物,对机体造成各种不良后果。DNA对活性氧特别敏感,ROS能引起DNA的多种类型损伤,可形成种类繁多的具有致DNA突变作用的碱基氧化产物,其中鸟嘌呤8位碳原子的氧化最常见,其氧化产物8-羟基鸟嘌呤被视为DNA氧化损伤的生物标志物。机体具有多种途径修复DNA氧化损伤,对于这种DNA损伤修复的主要代表酶有MutT同源酶即8-羟基鸟嘌呤核苷酸(MTH1)和8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(OGG1),MTH1能够分解核苷酸池中的8-羟基鸟嘌呤,可以减少8-oxodGTP结合到DNA上,而OGG1则是能切除DNA中被氧化的碱基。本文将阐述氧化损伤的种类、危害及其修复的途径,着重于氧化损伤修复中的主要修复基因OGG1和MTH1的结构功能、表达与疾病关系的研究进行综述。

氡吸入染毒对大鼠肺组织的DNA氧化损伤效应

研究吸入放射性气体氡及其子体对大鼠肺组织的DNA损伤效应。采用雄性Wistar大鼠16只,随机分为4组,每组4只。动物整体暴露于多功能生态氡室,吸入氡及其子体的累积剂量分别达到64、121和236工作水平月(Working level month,WLM)。激光共聚焦检测肺泡灌洗液(BALF)细胞内活性氧(Reactive oxygenspecies,ROS)水平,ELISA法检测肺组织8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine,8-OHdG)含量、RT-PCR检测肺组织8羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1型(8-oxoguanine DNA-glycosylase type 1,OGG1)mRNA和8-羟基脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷酶(Nucleoside diphosphate linked moiety X-type motif 1,MTH1)mRNA相对表达水平。氡吸入染毒后肺组织8-OHdG含量显著升高,BALF细胞ROS增加,OGG1和MTH1表达呈下降趋势。氡及其子体吸入可导致肺组织细胞的DNA氧化损伤,主要表现为8-OHdG含量的增加和修复酶活性的降低。