鲱精DNA纤维水合状态的振动谱特征

利用拉曼散射光谱测试技术，对不同温度处理后获得的各种相对湿度下的鲱精ＤＮＡ纤维进行脱氧核苷Ｃ—Ｈ振动与结合水Ｏ—Ｈ振动行为分析，以揭示其中结合水的数量特征。结果表明，运用２５９２６×Ｉ２９６４／Ｉ３０２４新指标所获数据与文献报道的小牛胸腺ＤＮＡ水合状态拉曼数据不同，但与小牛胸腺ＤＮＡ、鲑精ＤＮＡ的红外、Ｘ射线衍射、重量分析及差示扫描量热分析所得数据相吻合，证明拉曼分析公式的修订是成功的。鲱精ＤＮＡ纤维应与上述二种ＤＮＡ纤维具有同样的水合状态，每核苷酸对含有９～１４个结合水分子。

DNA纤维热变性过程的差示扫描量热分析

鲱精ＤＮＡ纤维的差示扫描量热（ＤＳＣ）谱中，除存在一个高温区的变性峰以外，还有３个低温区的吸热峰，类似于蛋白质ＤＳＣ分析中出现的“变性前峰”。经过２５３１５Ｋ（－２０℃）冻结处理的ＤＮＡ纤维，空间结构稳定性提高，变性前峰峰温增加４～８Ｋ。冻结与非冻结两类样品中，变性前峰的焓值分别为－１０２５３和－７７６５ｋＪ·ｍｏｌ－１。作者探讨了ＤＮＡ变性前峰的成因，并认为ＤＮＡ变性过程中的多元性可能与碱基序列特异性有关。

适用于棉花荧光原位杂交的DNA纤维高效制备技术

棉花富含酚类和多糖等高分子次生化合物,细胞质浓厚,且染色体形态小、数目多、制片困难,至今还未见棉花DNA纤维制备方面的报道。本研究用"刀切引流法",在含有Triton X-100和PVP40的冰冷细胞核提取缓冲液中,用锋利的刀片切割发育一周的棉花黄化子叶以释放棉花细胞核,所得细胞核干净完整杂质少,不需要研磨和巯基乙醇等处理,方便快捷无毒害,成功率达到100%。细胞核在室温下经温和碱裂解去除染色质上的蛋白质后,以前端导引裂解液铺展载玻片,即"引流法"拉伸制备DNA纤维,避免了液体表面张力的影响,消除了因载玻片推抹用力不均而导致的DNA纤维堆积和断裂,所制备的DNA纤维平直完整、伸展程度均匀、背景清晰。用基因组和45S rDNA分别标记探针进行杂交,结果表明所制备的棉花DNA纤维适用于荧光原位杂交。本研究探索出一套简单、高效、快捷、无毒害的适宜于棉花荧光原位杂交的DNA纤维制备技术,必将为棉花基因组研究和全基因组序列的最终完成提供强有力的技术支持。

DNA纤维质子化及脱嘧啶的拉曼光谱研究

对鲱精DNA纤维用pH 1 85酸溶液处理不同时间后 ,将样品进行拉曼光谱分析。结果表明DNA分子发生明显的质子化作用 ,有部分GC碱基对之间形成Hoogsteen型氢键的证明。酸不仅导致了DNA中部分嘌呤的脱落 ,同时还有部分嘧啶的脱落 ,其原因与嘧啶的质子化可能强于嘌呤有关。质子化、脱嘌呤、脱嘧啶的共同作用进一步引起原有正常配对的氢键断裂 ,DNA分子内双链状态不稳定 ,可见酸处理DNA时发生了酸变性这一现象 ,但其产物性质显著不同于热变性或碱变性产物。

小麦根尖细胞同步化诱导和DNA纤维的制备

为了简易快速地获得大量小麦（Triticum aestivumL．）中期染色体和DNA纤维，以普通小麦根尖为材料，采用羟基脲（hydroxyurea，简称HU），氟乐（trifluralin）结合的双阻断法进行了染色体中期同步化诱导。结果表明，染色体有丝分裂中期指数（metaphaseindex）达70％～80％；以同材料小麦黄化苗提取小麦细胞核，成功制备出小麦DNA纤维。这为研究细胞有丝分裂的调控、染色体形态结构、易位染色体检测和易位染色体片段的精确测量与定位等提供了新的技术支撑。

利用粗线期染色体和DNA纤维的FISH分析水稻端粒序列(英文)

利用粗线期染色体和DNA纤维的荧光原位杂交(FISH)技术分析了水稻广陆矮四号(Oryzasativassp.indicacv.GuangluaiNo.4)的端粒序列。粗线期染色体荧光原位杂交结果表明,大多数染色体的末端都有端粒串联重复,但信号的强度在不同染色体上是不同的。伸展DNA纤维荧光原位杂交结果显示,端粒最长的线状信号长度为6.55μm,最短的为1.82μm,依据2.51kb/μm的标准,它们分别相当于16.44kb和4.56kb。端粒的平均信号长度为3.62±1.32μm,相当于9.09±3.31kb。由此可以估计,最长的、最短的和平均长度的端粒拷贝数约为2349、651和1298±473。

DNA纤维经醋酸处理后脱嘌呤的拉曼谱带分析

鲱鱼精DNA纤维经醋酸处理 ,0.5h内以B型构象为主 ,这是酸溶液溶解DNA纤维的结果 ;DNA纤维在醋酸中浸润17h后 ,A、B型构象都存在 ,以A型居多 ;在拉曼光谱分析中 ,由于存在醋酸脱嘌呤的干扰 ,所以主链构象仅依磷酸脱氧核糖核酸主链—OPO—特征模得出的结论为准 ;DNA经酸处理后 ,拉曼图谱中表征N9R糖苷键的诸峰均减色明显 ,有些甚至消失 ,这表明了脱嘌呤变化 ;在该过程中 ,碱基质子化作用也极为显著 ,它与脱嘌呤变化的共同作用导致N3、N7、N9 原子两侧各键的电子云有不同程度减色 ,它们均导致了DNA双链之间氢键的断裂 ,使有关特征峰表现出相应的变化 ,但醋酸处理DNA并不导致DNA单链的断裂。

甘蓝染色体及伸长DNA纤维制备技术的研究

以甘蓝根尖、花药、黄化苗等为材料,初步建立了甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂粗线期染色体以及伸长DNA纤维等3种具有不同空间分辨率的靶DNA载体的制备技术.结果表明:通过变温处理可以有效提高前中期染色体分裂相比率;采用0.002 mol/L 8-羟基喹啉20℃预处理1 h、2%纤维素酶和2%果胶酶混合液37℃酶解约2 h、0.075 mol/L氯化钾25℃低渗30 min,制备的前中期染色体效果最佳;2%纤维素酶和2%果胶酶混合液37℃酶解约3 h,可获得伸展良好、背景干净的粗线期染色体;分子梳理法与移动界面法相比,前者制备的伸长DNA纤维效果较好.此方法的建立为荧光原位杂交技术在甘蓝相关研究领域的应用打下了坚实的基础.

双色FISH和DNA纤维FISH方法的建立与应用

在构建了含毛细胞白血病相关的结构性倒位inv(5)(p13.1q13.3)的细胞系后,为了确定该新建细胞系在建株过程中其倒位断裂点关键区遗传物质是否发生改变,以生物素或地高辛标记的cCI5-216和cCI5-267黏粒DNA为探针,进行染色体中期、间期和DNA纤维3种双色荧光原位杂交的分析。结果表明:该新建细胞系的3种双色荧光原位杂交结果,均与该细胞系的原代细胞的完全相同,证实了该细胞系倒位断裂点关键区的遗传物质结构未发生改变。该细胞系是揭示毛细胞白血病发病的分子机理的重要研究材料。

苹果细菌人工染色体双色DNA纤维荧光原位杂交体系的建立及应用

【目的】建立苹果DNA纤维荧光原位杂交(Fiber FISH)技术体系,从而为利用该技术确定苹果基因组DNA序列间的位置关系、构建精细物理图谱等方面的应用奠定基础。【方法】以‘Florina’苹果幼叶为试材,通过液氮研磨,尼龙膜过滤和TritonX-100去除叶绿素等步骤提取细胞核。细胞核经碱裂解,采用盖玻片拉伸方法制备DNA纤维。比较细胞核不同裂解时间和在5种不同包被类型的载玻片上DNA纤维拉伸的效果。用碱裂解方法提取来自苹果‘Florina’自交不亲和S9基因座的4个细菌人工染色体(Bacterium Artificial Chromosome)BAC 34G16、BAC 45M19、BAC 70J19和BAC 69A4。提取的质粒经PEG纯化,用地高辛或生物素标记探针。探针与DNA纤维制片经过80℃变性、37℃杂交2—3 d和洗片,采用"三明治"方法进行信号放大和检测,在荧光显微镜下观察试验结果。【结果】建立了以苹果幼叶为材料,液氮研磨提取细胞核,碱裂解细胞核和盖玻片拉伸制备DNA纤维的试验方法。提取的细胞核纯净、结构完整,细胞核浓度>5×103个/μL。试验结果表明,细胞核裂解4 min,在多聚赖氨酸包被的载玻片上制备的DNA纤维平直、伸展均匀,纤维量多、细长,效果好。经原位杂交和信号检测,获得了清晰的、具有Fiber FISH典型特征的"念珠状"杂交信号。对已知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 34G16和BAC 45M19进行杂交信号测量和分析,得出BAC克隆大小(Y,Kb)与信号长度(X,μm)的相关方程为Y=3.47X(R2=0.9215),其斜率即为该试验技术体系Fiber FISH的分辨率3.47 kb·μm-1。试验对未知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 70J19和BAC 69A4成功地进行了鉴定,它们大小分别为(112.1±18.4)kb和(133.2±16.3)kb,之间有(90.2±7.3)kb的重叠区域。【结论】建立了以苹果幼叶提取细胞核,制备DNA纤维和原位杂交的方法,获得了高分辨率的苹果DNA纤维原位杂交试验技术体系。

鲱精DNA纤维水合状态的拉曼分析

本文对鲱精ＤＮＡ纤维２９００～３４００ｃｍ－１区间的拉曼光谱特征模进行分析，发现反映主链骨架Ｃ－Ｈ振动的２９６４和２９５０ｃｍ－１模对ＤＮＡ纤维空间构象有敏感性。在不同水合状态下，结合水Ｏ－Ｈ伸缩振动３２０４ｃｍ－１模比３２２０ｃｍ－１相对稳定，是计算纤维水合参数的重要依据。用公式２．５９２６×Ｉ２９６４／Ｉ３２０４求出的结合水分子的数量及样品相对湿度值，与Ｐｒｅｓｃｏｔ的数据相比。

玉米DNA纤维的制备及端粒DNA的Fiber-FISH

[目的]建立了一种快速制备DNA纤维的方法,用端粒DNA在玉米纤维上进行物理定位。[方法]采用刀切法从玉米嫩叶中提取细胞核。以端粒DNA为探针,在玉米DNA纤维上进行伸展DNA纤维的荧光原位杂交（Fiber-FISH）,研究端粒DNA重复序列在玉米染色体上的拷贝数。[结果]用刀切法提取玉米细胞核,提高了核的完整性,并改善了DNA纤维的制备效果。玉米细胞核裂解的最佳时间为8-9 min。玉米的Fiber-FISH试验结果表明,杂交信号为伸展的念珠状长链,玉米各条染色体端粒DNA的长度为7-103μm,各染色体端粒重复序列的拷贝数存在显著差异（为15~230 kb）。[结论]玉米各染色体中端粒的长度可能不同,而且随着玉米生长及环境的变化,各条染色体端粒DNA长度的变化也不一致。

莲藕DNA纤维的制备方法

建立了一种高效制备莲藕伸展DNA纤维的方法 。

水稻中期染色体和DNA纤维的高效制备技术

水稻中期染色体和DNA纤维制备是水稻分子细胞遗传学研究中的关键技术。目前,这两个技术还有很多不足,该研究建立了高效制备水稻中期染色体和DNA纤维的方法。该方法制备的染色体,分裂相多、杂质少、背景清晰、染色体分散且形态好,水稻根尖分生组织细胞的分裂指数高达25%。植物细胞的细胞壁是制备DNA纤维的最大障碍,所以必须先提取细胞核,然后裂解细胞核释放出DNA纤维。在这个研究中,还建立了一个用刀切法分离细胞核,进而用SDS裂解核膜,用载玻片拖出DNA来制备水稻DNA纤维的方法。该方法制备的DNA纤维多呈平行的细线,背景清晰,伸展的程度均匀,适合于原位杂交。

在植物粗线期染色体和DNA纤维上的荧光原位杂交技术

介绍了两种荧光原位杂交技术的详细实验步骤。第一种技术是在减数分裂粗线期染色体上的荧光原位杂交，包括从花粉母细胞中制备粗线期染色体和在这种染色体上定位ＤＮＡ序列，其分辨率水平能够达到１００ｋｂ。第二种技术是从植物细胞核中制备ＤＮＡ纤维，并在上面进行原位杂交，能够直接分析ＤＮＡ序列的分子排列关系，其分辨率水平能达到几个ｋｂ。为了说明这两种原位杂交技术在研究基因组和染色体结构、构建高分辨率的ＤＮＡ物理图谱上的能力，将展示用该技术直接分析番茄染色体端粒重复序列和端粒联接重复序列的染色体定位和ＤＮＡ分子排列。

利用精密作图和DNA纤维荧光原位杂交把灯笼椒抗烟草花叶病毒属病毒L^3基因定位于含高度重复序列的类抗病基因簇的400kb区

我们用辣椒(Capsicum annuum)栽培种(已导入了灯笼椒Capsicum chinenseL3基因)的种内F2代群体(2016株)和种间F2代群体(3391株)(由灯笼椒与Capsicum frutescence杂交产生)对灯笼椒抗烟草花叶病毒属病毒的L3基因进行定位。通过L3基因抗性紧密相关的AFLP分子标记的BAC文库的分析,揭示出番茄抗病同源基因I2的存在。通过简并PCR技术,对来自35株不同辣椒的同源基因I2的部分或全部编码序列进行克隆,且在种间组合中产生了17个遗传标记。图谱显示:L3基因位于I2同源基因标记IH1-04和BAC-end标记189D23M中间,L3基因定位于包含两个不同BAC重叠群的区内,这两个不同的BAC重叠群分别由4个和1个无性系组成。DNA纤维荧光原位杂交揭示这两个重叠群被约30kb隔开。DNA纤维荧光原位杂交结果和BAC无性系的Southern杂交表明在高度重复序列中富集包含L3基因位点的区。Southern杂交表明两个BAC重叠群包含多于十个的I2同源基因拷贝体。相反,对于种间F2代群体,,重组后代没有结合位点,在种内F2代群体中,该结合位点存在于两个不同的BAC重叠群内,这两个不同的BAC重叠群分别由7个和2个无性系组成。而且,两个群体间结合位点分配的不同表明在含有L基因位点的区域连锁不平衡。

利用精密作图和DNA纤维荧光原位杂交把灯笼椒抗烟草花叶病毒属病毒L^3基因定位于含高度重复序列的类抗病基因簇的400Kb区(连载)

结果 L^3基因的初步定位 我们首先利用NK群体定位了L^3基因，NK群体是辣椒栽培品种（C．annuumcultivar）和从灯笼椒（C．chinense）PI152225导入的含有L^3基因的衍生品种种内杂交的F2代群体。对抗PMMoV及敏感的F2后代的大量DNA进行三轮AFLP分析发现了应用7个组合的选择性PCR引物扩增到8个多态性DNA片段。从其中得到了两个SCAR标记。

大麦45S和5SrDNA定位及5SrDNA伸展纤维的FISH分析

用荧光原位杂交技术对45S和5SrDNA在大麦(HordeumvulgareL.)有丝分裂中期染色体进行了确定分析,较强的45SrDNA信号共有2对,分别分布在大麦的第1染色体的短臂和第2染色体的长臂。而5SrDNA则只有1对杂交信号,位于第3染色体的长臂,但信号较弱。用伸展DNA纤维的荧光原位杂交(Fiber-FISH)技术测定了5SrDNA在大麦的基因组中的拷贝数,计算出5SrDNA的拷贝数约为408～416。对大麦品种中rDNA位点数目的可变性进行了讨论。

DNA纤维上的原位杂交技术

DNA纤维上的荧光原位杂交(Fiber-FISH)技术是一种非常重要的分子细胞遗传学技术。对于高分辨物理图的绘制、基因组和染色体结构的研究、致病基因的定位克隆等都有很大作用,本文介绍了该技术的基本操作和应用,以及与引物原位DNA合成(PRINS)等技术相结合进行更精确基因定位的潜力。