苹果细菌人工染色体双色DNA纤维荧光原位杂交体系的建立及应用

【目的】建立苹果DNA纤维荧光原位杂交(Fiber FISH)技术体系,从而为利用该技术确定苹果基因组DNA序列间的位置关系、构建精细物理图谱等方面的应用奠定基础。【方法】以‘Florina’苹果幼叶为试材,通过液氮研磨,尼龙膜过滤和TritonX-100去除叶绿素等步骤提取细胞核。细胞核经碱裂解,采用盖玻片拉伸方法制备DNA纤维。比较细胞核不同裂解时间和在5种不同包被类型的载玻片上DNA纤维拉伸的效果。用碱裂解方法提取来自苹果‘Florina’自交不亲和S9基因座的4个细菌人工染色体(Bacterium Artificial Chromosome)BAC 34G16、BAC 45M19、BAC 70J19和BAC 69A4。提取的质粒经PEG纯化,用地高辛或生物素标记探针。探针与DNA纤维制片经过80℃变性、37℃杂交2—3 d和洗片,采用"三明治"方法进行信号放大和检测,在荧光显微镜下观察试验结果。【结果】建立了以苹果幼叶为材料,液氮研磨提取细胞核,碱裂解细胞核和盖玻片拉伸制备DNA纤维的试验方法。提取的细胞核纯净、结构完整,细胞核浓度>5×103个/μL。试验结果表明,细胞核裂解4 min,在多聚赖氨酸包被的载玻片上制备的DNA纤维平直、伸展均匀,纤维量多、细长,效果好。经原位杂交和信号检测,获得了清晰的、具有Fiber FISH典型特征的"念珠状"杂交信号。对已知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 34G16和BAC 45M19进行杂交信号测量和分析,得出BAC克隆大小(Y,Kb)与信号长度(X,μm)的相关方程为Y=3.47X(R2=0.9215),其斜率即为该试验技术体系Fiber FISH的分辨率3.47 kb·μm-1。试验对未知大小和位置关系的两个BAC克隆BAC 70J19和BAC 69A4成功地进行了鉴定,它们大小分别为(112.1±18.4)kb和(133.2±16.3)kb,之间有(90.2±7.3)kb的重叠区域。【结论】建立了以苹果幼叶提取细胞核,制备DNA纤维和原位杂交的方法,获得了高分辨率的苹果DNA纤维原位杂交试验技术体系。

DNA纤维荧光原位杂交技术

DNA纤维荧先原位杂交是一种分子细胞遗传学技术，现已应用于克隆排序、人类基因组高分辨物理图的绘制、染色体组织结构分析和致病基因的定位克隆等多个方面。本文总结了近年来该项技术在方法学、应用等方面的进展，并与其它染色体FISH方法进行比较。

利用精密作图和DNA纤维荧光原位杂交把灯笼椒抗烟草花叶病毒属病毒L^3基因定位于含高度重复序列的类抗病基因簇的400kb区

我们用辣椒(Capsicum annuum)栽培种(已导入了灯笼椒Capsicum chinenseL3基因)的种内F2代群体(2016株)和种间F2代群体(3391株)(由灯笼椒与Capsicum frutescence杂交产生)对灯笼椒抗烟草花叶病毒属病毒的L3基因进行定位。通过L3基因抗性紧密相关的AFLP分子标记的BAC文库的分析,揭示出番茄抗病同源基因I2的存在。通过简并PCR技术,对来自35株不同辣椒的同源基因I2的部分或全部编码序列进行克隆,且在种间组合中产生了17个遗传标记。图谱显示:L3基因位于I2同源基因标记IH1-04和BAC-end标记189D23M中间,L3基因定位于包含两个不同BAC重叠群的区内,这两个不同的BAC重叠群分别由4个和1个无性系组成。DNA纤维荧光原位杂交揭示这两个重叠群被约30kb隔开。DNA纤维荧光原位杂交结果和BAC无性系的Southern杂交表明在高度重复序列中富集包含L3基因位点的区。Southern杂交表明两个BAC重叠群包含多于十个的I2同源基因拷贝体。相反,对于种间F2代群体,,重组后代没有结合位点,在种内F2代群体中,该结合位点存在于两个不同的BAC重叠群内,这两个不同的BAC重叠群分别由7个和2个无性系组成。而且,两个群体间结合位点分配的不同表明在含有L基因位点的区域连锁不平衡。

利用精密作图和DNA纤维荧光原位杂交把灯笼椒抗烟草花叶病毒属病毒L^3基因定位于含高度重复序列的类抗病基因簇的400Kb区(连载)

结果 L^3基因的初步定位 我们首先利用NK群体定位了L^3基因，NK群体是辣椒栽培品种（C．annuumcultivar）和从灯笼椒（C．chinense）PI152225导入的含有L^3基因的衍生品种种内杂交的F2代群体。对抗PMMoV及敏感的F2后代的大量DNA进行三轮AFLP分析发现了应用7个组合的选择性PCR引物扩增到8个多态性DNA片段。从其中得到了两个SCAR标记。

适用于棉花荧光原位杂交的DNA纤维高效制备技术

棉花富含酚类和多糖等高分子次生化合物,细胞质浓厚,且染色体形态小、数目多、制片困难,至今还未见棉花DNA纤维制备方面的报道。本研究用"刀切引流法",在含有Triton X-100和PVP40的冰冷细胞核提取缓冲液中,用锋利的刀片切割发育一周的棉花黄化子叶以释放棉花细胞核,所得细胞核干净完整杂质少,不需要研磨和巯基乙醇等处理,方便快捷无毒害,成功率达到100%。细胞核在室温下经温和碱裂解去除染色质上的蛋白质后,以前端导引裂解液铺展载玻片,即"引流法"拉伸制备DNA纤维,避免了液体表面张力的影响,消除了因载玻片推抹用力不均而导致的DNA纤维堆积和断裂,所制备的DNA纤维平直完整、伸展程度均匀、背景清晰。用基因组和45S rDNA分别标记探针进行杂交,结果表明所制备的棉花DNA纤维适用于荧光原位杂交。本研究探索出一套简单、高效、快捷、无毒害的适宜于棉花荧光原位杂交的DNA纤维制备技术,必将为棉花基因组研究和全基因组序列的最终完成提供强有力的技术支持。

在植物粗线期染色体和DNA纤维上的荧光原位杂交技术

介绍了两种荧光原位杂交技术的详细实验步骤。第一种技术是在减数分裂粗线期染色体上的荧光原位杂交，包括从花粉母细胞中制备粗线期染色体和在这种染色体上定位ＤＮＡ序列，其分辨率水平能够达到１００ｋｂ。第二种技术是从植物细胞核中制备ＤＮＡ纤维，并在上面进行原位杂交，能够直接分析ＤＮＡ序列的分子排列关系，其分辨率水平能达到几个ｋｂ。为了说明这两种原位杂交技术在研究基因组和染色体结构、构建高分辨率的ＤＮＡ物理图谱上的能力，将展示用该技术直接分析番茄染色体端粒重复序列和端粒联接重复序列的染色体定位和ＤＮＡ分子排列。

甘蓝rDNA及C_0t-1 DNA荧光原位杂交及其核型分析

为了探索一种高效可靠的芸薹属植物核型分析方法,本文以甘蓝品种黑叶小平头为实验材料,从其基因组DNA中分离出C0t-1 DNA并用生物素标记作探针,对有丝分裂中期相染色体进行原位杂交,每对染色体上均显示出了特定的荧光原位杂交带型.将植物25S和5S rDNA分别用地高辛和生物素标记作探针,单色荧光原位杂交结果显示黑叶小平头2对染色体具有25S rDNA基因座,1对染色体具有5S rDNA基因座.生物素标记的C0t-1 DNA与地高辛标记的25S rDNA等量混合作探针,双色荧光原位杂交证实了C0t-1 DNA与25S rDNA二者具有一致的染色体位置特征,表明基于rDNA及C0t-1 DNA荧光原位杂交的核型分析技术,优于目前普遍采用的只基于rDNA荧光原位杂交的核型分析方法.结合已报道的rDNA染色体定位结果,及C0t-1 DNA荧光原位杂交带型与染色体形态,更准确地构建了甘蓝的核型.

荧光原位杂交技术在法庭科学DNA检验中的应用

目的运用荧光原位杂交技术结合激光显微切割技术,分离法医物证男女混合样本中的男性细胞和女性细胞,并进行DNA分型。方法通过双色荧光原位杂交,Y染色体标记上绿色信号,X染色体标记上红色信号,在荧光显微镜下识别男性细胞和女性细胞,并通过激光显微切割技术分别获得男性细胞和女性细胞进行DNA分型。结果运用荧光原位杂交技术,能够分别标记法医物证男女混合样本中的男性细胞和女性细胞,并通过激光显微切割技术获得各自的DNA分型。结论荧光原位杂交技术结合激光显微切割技术,可应用于法医物证男女混合样本的检验,提高个体识别能力。

荧光原位杂交技术对无创DNA产前检测阳性病例的诊断价值

目的:探讨荧光原位杂交检测技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)对无创DNA产前检测(noninvasive prenatal testing,NIPT)阳性病例的诊断价值。方法:对22例NIPT阳性病例的未培养羊水利用FISH技术进行胎儿13、18、21、X和Y染色体数目的检测,同时将所有病例的羊水或脐血细胞培养行常规染色体G显带染色体核型分析。应用Kappa检验比较FISH和染色体核型分析检测结果的一致性并进行分析。结果:22例样本FISH检测结果中,18例检测出胎儿染色体非整倍体异常,包括13-三体2例、21-三体11例、18-三体1例、XXY/XY嵌合型1例、XXY型1例、XXXXY型1例、XYY型1例,余下4例未发现染色体数目异常。FISH检测结果与染色体核型分析结果一致性极强(κ=1)。结论:NIPT存在假阳性结果,阳性病例必须进行进一步产前诊断,FISH技术具有快速,简便,准确的技术特点,是快速确诊的有效手段。

整体荧光原位杂交用于检测水稻特异DNA程序的研究

文章报道了整体荧光原位杂交应用于检测水稻特异ＤＮＡ的实验程序利用该实验方法，以经地高辛（ｄｉｇｏｘｉｎ，ＤＩＧ）标记的ｒＤＮＡ作为探针，成功地在水稻根尖和花药内部组织检测到与探针互补的片段对于实验方法，结果表明，整体荧光原位杂交的成功与否受到多种因素的影响，包括组织的种类、固定剂的种类以及固定后的处理方法（主要是酶解与否）等检测根尖ＤＮＡ可以采用φ（福尔马林）＝１％固定加上酶解；检测花药（花粉发育处于单核期）ＤＮＡ也可以采用φ（福尔马林）＝１％固定。

莲C_0t-1 DNA的荧光原位杂交分析

为分析中国莲C_0t-1 DNA在其中期染色体上的分布,从中国莲基因组DNA中分离出C_0t-1 DNA,将基因组和所分离的C_0t-1 DNA用生物素标记后作探针,对中国莲染色体进行原位杂交。杂交结果用耦联有荧光素Cy3的生物素抗体检测,发现在每对染色体上均显示出特定的荧光原位杂交带。同时分析了FISH和GISH信号分布的异同。基于C_0t-1 DNA荧光原位杂交带型及染色体型,构建了中国莲核型。

毛细胞白血病5q13.3断裂位点线性DNA荧光原位杂交定位

毛细胞白血病经常与 5q1 3.3断裂位点相关联 ,该断裂位点区域及位于这一区域的重要基因有待研究 .我们探索了 DNA纤维荧光原位杂交方法 (即 DNA纤维 FISH)检测该断裂位点的可行性 .实验选用含有断裂位点区域的两个基因组克隆及位于断裂位点两侧的两个cos质粒探针与带有结构性倒位 (5) (p1 3.1 q1 3.3)的线性 DNA共杂交 (DNA来自 HCL患者的细胞系 ) .实验证明该断裂位点将探针信号一分为二 .根据这些结果描绘出断裂位点区域图 .研究表明 ,DNA纤维

大肠癌细胞线粒体DNA与NIH3T3细胞核基因组整合的荧光原位杂交分析

目的:观察大肠癌细胞突变的线粒体DNA(mtDNA)转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,mtDNA与转染细胞核内基因组的整合情况。方法:将携带大肠癌细胞突变mtDNA的重组质粒pcDNA3.1(+)-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1(+)-NHWBC mtDNA及空质粒pcDNA3.1(+)通过脂质体法转染NIH3T3细胞。同时用PCR法制备3条相应的绿色荧光蛋白标记的mtDNA探针。分离转染的NIH3T3细胞核内染色体,用荧光原位杂交(FISH)法检测mtDNA探针与核内基因组的整合情况。结果与结论:瞬时转染的NIH3T3细胞核基因组上存在mtDNA的同源序列。外源肿瘤细胞mtDNA与NIH3T3细胞核内基因组发生整合。

用荧光原位杂交技术构建高分辨率的DNA物理图谱

用荧光原位杂交技术构建高分辨率的ＤＮＡ物理图谱钟筱波ＰａｕｌＦ．ＦｒａｎｓｚＪ．ＨａｎｓｄｅＪｏｎｇＰｉｍＺａｂｅｌ（荷兰瓦赫宁根农业大学分子生物学系）ＨｉｇｈＲｅｓｏｌｕｔｉｏｎＰｈｙｓｉｃａｌＭａｐｐｉｎｇｂｙＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕ...

液基细胞学、DNA倍体及荧光原位杂交对上尿路尿路上皮癌的诊断价值

目的探讨液基细胞学、DNA倍体及荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)在上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma,UTUC)定性诊断中的应用价值。方法回顾性分析2013年1月至2021年6月陆军特色医学中心收治的影像可疑UTUC患者246例,经组织病理确诊为UTUC 190例、非肿瘤病变43例、其他类型肿瘤13例;246例均有自然排尿标本的液基细胞学结果,其中178例有DNA倍体分析结果、167例有FISH结果,分别计算并比较液基细胞学、DNA倍体及FISH三者单独或联合对UTUC诊断的准确性。结果液基细胞学、DNA倍体及FISH诊断UTUC的敏感性分别为:44.7%、82.2%、57.9%,特异性分别为:97.7%、82.4%、92.3%,对高级别UTUC的诊断敏感性分别为:48.1%、87.7%、60.7%,对低级别UTUC诊断敏感性分别为:25.0%、52.4%、37.5%。三者结合任一阳性时诊断敏感性提升为93.8%(与三者单独比较均P<0.05);当任意两者同时阳性作为诊断UTUC的标准时,其阳性预测值及特异性均为100%。结论尿液基细胞学、DNA倍体和FISH对UTUC均有一定诊断价值,三者结合可有效提高诊断的敏感性或特异性。

荧光原位杂交在产前诊断中与无创DNA检测的对比研究

目的研究荧光原位杂交技术与无创DNA检测在快速诊断胎儿染色体数目异常的价值。方法使用荧光原位杂交技术(FISH),应用特异性探针对包含5例无创DNA确诊异常病例的372例胎儿羊水细胞进行荧光原位杂交。结果荧光原位杂交共检出染色体数目异常20例,异常率为5.4%,包括唐氏患儿14例,占全部异常数的70%,18-三体综合征3例,45,X2例,XXY1例,其中无创DNA送检的5例异常病例中有4例均为唐氏患儿,比例为80%,荧光原位杂交检测结果与羊水细胞核型分析结果相比较,在染色体数目异常方面两者符合率为95.2%(20/21)。结论 FISH技术用于快速诊断羊水细胞13、18、21、X,Y染色体数目时具有较高的临床价值,但不能作为单独的方法检测染色体异常,而无创DNA检验可作为产前筛查新技术向特定孕妇推广。

荧光原位杂交技术的发展与应用

The techniques of in situ hybridization (ISH) are widely adopted for analyzing the genetic make_up and RNA expression patterns of individual cells. There are four main criterions for evaluating this technique, including detection sensitivity, resolution, capacity and specificity. This review focuses on a number of advances made over the last years in the fluorescence in situ hybridization (FISH). These advances can be catagorized into several branches as follows: (1) Multicolor_FISH (mFISH), including conventional mFISH, combinatorial FISH, ratio labelling FISH, multicolor chromosome painting and comparative genomic hybridization (CGH); (2) Extended DNA fiber_FISH (EDF_FISH), including quantitative DNA fiber mapping (QDFM), molecular combing (MC) and dynamic molecular combing (DMC); (3) In situ PCR_based FISH; (4) Bacterial (or yeast) artificial chromosome_FISH (BAC_FISH or YAC_FISH); (5) Tyramide signal amplification_FISH (TSA_FISH); (6) Polypeptide nucleic acid_FISH (PNA_FISH) and (7) padlock_FISH.

荧光原位杂交技术的研究进展及其在染色体识别应用中的展望

荧光原位杂交技术是一门新兴的分子细胞遗传学技术,主要介绍了该技术的产生过程、基本原理、探针类型和标记方法以及发展历史,并对该技术在染色体识别中的应用作出展望。