DNA甲基化在肝纤维化中的研究进展

肝纤维化是一种由诸多理化因子共同作用下形成的肝内纤维结缔组织异常增殖的疾病阶段,促纤维化与抗纤维化基因机制失衡是肝纤维化的中心环节。DNA甲基化作为一种常用的表观遗传修饰途径,通过修改基因结构从而影响相关因子的功能表现。目前资料表明,纤维化相关基因甲基化程度与疾病的进展密切相关。本文就DNA甲基化在肝纤维化中的具体机制及近年来的研究进展作一综述,以期为肝病的病情评价、初步诊断及靶向治疗提供新思路。

乙肝病毒DNA、甲胎蛋白在CHB患者中的表达水平与病情及肝纤维化的关系

目的探讨乙肝病毒DNA(HBV DNA)、甲胎蛋白(AFP)在CHB患者中的表达水平与病情及肝纤维化的关系。方法选取120例CHB患者为对象,按照病情程度分为轻度组(n=23)、中度组(n=48)、重度组(n=36)、肝衰竭组(n=13);按照肝纤维化程度分为S0~S1组(n=21)、S2组(n=41)、S3组(n=42)、S4组(n=16)。以40例健康体检者为对照组。采用荧光定量PCR检测HBV DNA水平,采用化学发光法检测AFP水平,分析二者与CHB严重程度及肝纤维化的关系。结果CHB组HBV DNA及AFP高于对照组(P<0.05);AFP在CHB轻度组、中度组、重度组、肝衰竭组依次升高(P<0.05)。HBV DNA及AFP在对照组、S0~S1组、S2组、S3组、S4组依次升高(P<0.05)。相关性分析显示,HBV DNA与CHB纤维化程度正相关,AFP与CHB病情及纤维化程度均呈正相关(P<0.05)。HBV DNA、AFP联合检测诊断重度肝纤维化的AUC分别为0.800(95%CI:0.829~0.939)、0.846(95%CI:0.788~0.905)、0.884(95%CI:0.733~0.867)。结论HBV DNA及AFP在CHB患者中表达升高,AFP与CHB的严重程度及肝纤维化程度正相关,HBV DNA与肝纤维化程度正相关,检测二者有助于肝纤维程度的早期诊断。

玉米DNA纤维的制备及端粒DNA的Fiber-FISH

[目的]建立了一种快速制备DNA纤维的方法,用端粒DNA在玉米纤维上进行物理定位。[方法]采用刀切法从玉米嫩叶中提取细胞核。以端粒DNA为探针,在玉米DNA纤维上进行伸展DNA纤维的荧光原位杂交（Fiber-FISH）,研究端粒DNA重复序列在玉米染色体上的拷贝数。[结果]用刀切法提取玉米细胞核,提高了核的完整性,并改善了DNA纤维的制备效果。玉米细胞核裂解的最佳时间为8-9 min。玉米的Fiber-FISH试验结果表明,杂交信号为伸展的念珠状长链,玉米各条染色体端粒DNA的长度为7-103μm,各染色体端粒重复序列的拷贝数存在显著差异（为15~230 kb）。[结论]玉米各染色体中端粒的长度可能不同,而且随着玉米生长及环境的变化,各条染色体端粒DNA长度的变化也不一致。

实时荧光定量PCR法检测外源性DNA在重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中的残留

目的对实时荧光定量PCR(qPCR)法检测重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中的外源性DNA残留量进行探究和分析,确定该方法用于DNA质量控制的可行性。方法采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒(磁珠法)提取DNA,利用E.coli残留DNA检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行扩增反应,绘制标准曲线,建立重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中外源性DNA残留量的qPCR检测方法。结果对8批重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维进行测定,外源性DNA残留量在0.03~300 pg/μl内,重复性良好,均远低于每剂10 ng,线性良好(R^(2)>0.99),回收率均在50%~150%之间。结论该方法可用于重组Ⅲ型人源化胶原蛋白冻干纤维中外源性DNA残留量的定量测定。

沉默信息调节因子3通过调节线粒体功能障碍减轻特发性肺纤维化的研究进展

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种以进行性肺瘢痕形成为主要特征慢性进行性肺部疾病[1]。IPF属于典型且常见的纤维性间质性肺病,其病理进程不可逆转,往往会进展为呼吸衰竭和死亡[2],确诊后的平均预期寿命为3~5年[3]。抗纤维化药物pirfenidone和nintedanib可以改善IPF患者的肺功能,但其疗效不佳且副作用较大[4]。

NOS2基因DNA甲基化编辑调节NO浓度影响肌肉发育通路基因的表达

旨在探究对一氧化氮合成酶(NOS)2进行DNA甲基化编辑后对肌红蛋白的调控作用机制,并研究其对神经元一氧化氮合酶(nNOS)和内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)的表达水平是否有影响。本试验采用DNA甲基化编辑技术在猪肾细胞系PK-15细胞对基因NOS2进行甲基化编辑,在猪肾细胞中检测NOS2基因启动子DNA甲基化水平、NOS2表达水平、细胞内一氧化氮浓度以及肌纤维和肌红蛋白相关基因的表达。结果发现,NOS2基因启动子前500 bp区域平均DNA甲基化水平降低,但差异不显著,而gRNA2结合位点附近的CpG位点甲基化水平增高。此外,对NOS2进行甲基化编辑后,NOS2基因表达量和其iNOS蛋白质表达量显著降低。随着NOS2表达降低,nNOS和eNOS表达显著增加。MYHC-Ⅱb和MYHC-Ⅱx的表达水平显著下降,Myoglobin蛋白表达也显著下降。综上,NOS2基因的异常表达能够影响细胞中的NO生成,同时也会影响NOS1和NOS3的表达,以及和肌肉发育相关基因的表达。

Dnmt3b对髁突纤维软骨干细胞多向分化调控作用的实验研究

目的:探究DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase 3b enzyme,Dnmt3b)对大鼠髁突纤维软骨干细胞(fibrocartilage stem cells,FCSCs)成脂、成骨、成软骨向分化能力的影响。方法:体外分离培养大鼠髁突FCSCs,构建Dnmt3b过表达慢病毒,感染FCSCs建立过表达Dnmt3b的FCSCs细胞模型,并对其进行成脂、成骨、成软骨诱导培养,检测Dnmt3b过表达对大鼠髁突FCSCs成脂、成骨、成软骨相关基因表达的影响。结果:大鼠髁突纤维软骨干细胞具有间充质干细胞特性。与对照组相比,Dnmt3b过表达组成脂相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,Ppar-γ)的表达显著降低,成骨相关基因Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的表达显著升高,成软骨相关基因SRY相关转录因子9(SRY-related high mobility group-box gene 9,Sox9)、聚集蛋白聚糖(aggrecan,ACAN)的表达显著升高。结论:Dnmt3b能促进大鼠髁突纤维软骨干细胞成软骨向分化和成骨向分化,抑制其成脂向分化。

纸基法血液基因组DNA的提取与应用

建立一种提取小鼠血液中基因组DNA的纸基方法进行分子鉴定和基因分型,选择试剂盒提取法和常规煮沸法作为对比,分别对10只基因敲除型小鼠后代组织的基因组DNA进行提取,用多基因PCR扩增进行鉴定,随机选择2只小鼠的鉴定结果进行测序验证。PCR均扩增出符合预期大小的条带,验证了纸基法的稳定性和特异性。3种DNA提取方法的PCR扩增结果表明,试剂盒提取法与纸基法提取效果相似,共鉴定出4只野生型小鼠,5只基因敲除杂合型小鼠和1只基因敲除型纯合型小鼠;煮沸法对小鼠基因型DNA提取效果较差。测序分析结果显示,基因类型与纸基法鉴定基因类型一致。用纸基法提取基因组DNA不需要专业设备就可满足小鼠血液基因组DNA的提取及下游试验,可为基因型鉴定提供一种可靠快速的方法。

DNA损伤修复与特发性肺纤维化关系的研究进展

特发性肺纤维化(IPF)是一种能导致肺功能进行性损伤的间质性肺疾病。目前病因尚不明确,DNA损伤修复在IPF的发病机制中可能起着重要作用。细胞受到外界刺激导致DNA损伤时,DNA修复蛋白被激活并发挥修复功能,其过程主要由多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1及多种细胞因子介导,最终使受损DNA得到修复。该文就DNA损伤修复与IPF关系的研究进展进行综述。

乙肝大小三阳状态、不同HBVDNA载量孕妇肝功能指标水平分析

目的研究探讨乙肝孕妇大三阳和小三阳状态中乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)DNA载量、肝功能指标、肝纤维化标志物含量及不同HBVDNA载量孕妇的肝功能水平。方法选取临清市人民医院于2020年1月—2023年1月收治的120例乙肝孕妇作为研究对象,根据乙肝两对半检测结果将其分为两组,即大三阳组(n=60)和小三阳组(n=60)。比较两组HBVDNA载量、肝功能指标、肝纤维化标志物含量及不同HBVDNA载量孕妇的肝功能指标、肝纤维化标志物含量。结果大三阳组丙氨酸转移酶水平(29.00±7.62)U/L、HBVDNA水平(5.18±1.16)×10^(4)U/mL均高于小三阳组的(26.00±2.85)U/L、(2.08±1.11)×10^(4)U/mL,差异有统计学意义(t=2.856、14.956,P均<0.05)。大三阳组的重组人几丁质酶3样蛋白1水平低于小三阳组,差异有统计学意义(P<0.05)。伴随着HBVDNA载量上升,两组患者甲胎蛋白水平随之增加,但是在同等HBADNA载量下,两组甲胎蛋白水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论开展孕前抗乙肝病毒诊疗、孕期风险系数评估,采取科学有效的干预措施,均能够有效抑制乙肝在母婴中的传播。

丹参和川芎嗪对瘢痕成纤维细胞DNA含量及细胞周期进程的影响

应用流式细胞光度分析法测定丹参和川芎嗪对体外培养的瘢痕成纤维细胞ＤＮＡ相对含量和细胞周期时相变化，发现药物在一定浓度作用下，ＤＮＡ指数无明显变化；丹参使Ｃ２Ｍ期细胞分布增多，Ｇ２Ｍ期延长；川芎嗪使Ｇ２Ｍ期细胞分布增多，Ｇ２Ｍ期、Ｓ期延长；药物使细胞群体倍增时间延长，与浓度呈明显直线正相关。认为，丹参能抑制细胞的有丝分裂，川芎嗪能抑制细胞的ＤＮＡ合成、复制和有丝分裂。

球形纤维素固定化DNA制备免疫吸附剂

以球形纤维素为载体 ,经环氧氯丙烷活化后共价键联小牛胸腺 DNA,制备 DNA免疫吸附剂 ,通过血液灌流能够治疗系统性红斑狼疮 .对病人血清的吸附实验结果表明 ,每毫升吸附剂与 3 m L病人血清混合 ,于 3 7℃保温 1 h,可吸附除去 4 0 %～ 70

辛伐他汀对鼠心脏成纤维细胞DNA合成的影响

目的探讨辛伐他汀(Sim)对新生SD大鼠心脏成纤维细胞(CFs)DNA合成的影响及甲羟戊酸(MVA)的干预效应。方法采用胰酶消化、差速贴壁法培养新生SD大鼠CFs,以3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法测定DNA合成,观察不同浓度Sim及MVA分别作用不同时间对CFsDNA合成功能的影响。结果 (1)CFs的3H-TdR掺入率随着Sim干预浓度的增加而降低,其中10-6和10-5mol／L Sim组的3H-TdR掺入率分别为(1175±202．66)、(771±164．86)cpm／2000细胞, 显著低于对照组的(1608±204．32)cpm／2000细胞(均P<0．01);(2)10-5mol／L Sim作用CFs 6、12、18、24、30、36、42、48 h, 随着Sim作用时间的延长,CFs的3H-TdR掺入率呈递减趋势,与时间呈明显的负相关(r=-919,P<0．01);(3)CFs的3H-TdR 掺入率随着MVA干预浓度的增加呈进行性上升,其中10-4、10-3 mol／L MVA+10-5 mol／LSim组3H-TdR掺入率分别为 (1612±308．57)、(1995±353．83)cpm／2000细胞,显著高于对照10-5mol/L Sim组的(771±164．86)cpm／2000细胞(P<0．01); (4)10-3 mol／L MVA分别作用CFs 6-48 h,CFs的3H-TdR掺入率随着MVA作用时间的延长而逐渐增加,呈明显的正相关(r=0．968,P<0．01)。结论 Sim呈浓度-时间依赖方式抑制CFs DNA的合成且可被MVA拮抗,提示Sim可抑制CFs 增殖,延缓心肌纤维化,其作用可能通过MVA途径实现。

DNA检测技术在天然动物纤维鉴别中的应用

自1985年PCR技术诞生起,各种基于DNA技术的研究应用也如火如荼地展开。随着生物技术和生命科学的飞速发展,DNA检测技术以其客观性和精准性在食品、动植物检疫、医疗诊断、司法鉴定及环境监测等领域得到了广泛的应用。

小麦根尖细胞同步化诱导和DNA纤维的制备

为了简易快速地获得大量小麦（Triticum aestivumL．）中期染色体和DNA纤维，以普通小麦根尖为材料，采用羟基脲（hydroxyurea，简称HU），氟乐（trifluralin）结合的双阻断法进行了染色体中期同步化诱导。结果表明，染色体有丝分裂中期指数（metaphaseindex）达70％～80％；以同材料小麦黄化苗提取小麦细胞核，成功制备出小麦DNA纤维。这为研究细胞有丝分裂的调控、染色体形态结构、易位染色体检测和易位染色体片段的精确测量与定位等提供了新的技术支撑。

大麦45S和5SrDNA定位及5SrDNA伸展纤维的FISH分析

用荧光原位杂交技术对45S和5SrDNA在大麦(HordeumvulgareL.)有丝分裂中期染色体进行了确定分析,较强的45SrDNA信号共有2对,分别分布在大麦的第1染色体的短臂和第2染色体的长臂。而5SrDNA则只有1对杂交信号,位于第3染色体的长臂,但信号较弱。用伸展DNA纤维的荧光原位杂交(Fiber-FISH)技术测定了5SrDNA在大麦的基因组中的拷贝数,计算出5SrDNA的拷贝数约为408～416。对大麦品种中rDNA位点数目的可变性进行了讨论。

适用于棉花荧光原位杂交的DNA纤维高效制备技术

棉花富含酚类和多糖等高分子次生化合物,细胞质浓厚,且染色体形态小、数目多、制片困难,至今还未见棉花DNA纤维制备方面的报道。本研究用"刀切引流法",在含有Triton X-100和PVP40的冰冷细胞核提取缓冲液中,用锋利的刀片切割发育一周的棉花黄化子叶以释放棉花细胞核,所得细胞核干净完整杂质少,不需要研磨和巯基乙醇等处理,方便快捷无毒害,成功率达到100%。细胞核在室温下经温和碱裂解去除染色质上的蛋白质后,以前端导引裂解液铺展载玻片,即"引流法"拉伸制备DNA纤维,避免了液体表面张力的影响,消除了因载玻片推抹用力不均而导致的DNA纤维堆积和断裂,所制备的DNA纤维平直完整、伸展程度均匀、背景清晰。用基因组和45S rDNA分别标记探针进行杂交,结果表明所制备的棉花DNA纤维适用于荧光原位杂交。本研究探索出一套简单、高效、快捷、无毒害的适宜于棉花荧光原位杂交的DNA纤维制备技术,必将为棉花基因组研究和全基因组序列的最终完成提供强有力的技术支持。

HBVDNA的表达与肝纤维化形成的相关性研究

探讨HBVDNA的表达与肝纤维化形成的相关性。应用荧光定量PCR技术测定 2 0 0例乙肝患者和 4 9名健康对照组的血清HBVDNA ,同时用放免法检测层粘连蛋白 (LN)、透明质酸 (HA)、Ⅲ型前胶原 (PⅢ )、Ⅳ型胶原 (Ⅳ .C)水平。HBVDNA表达阳性组LN、HA、PⅢ、Ⅳ .C的含量〔(16 4 8± 5 6 1)、(16 6 1± 78 0 )、(15 3 5± 6 0 7)、(92 1±2 9 9) μg/L〕显著高于HBVDNA阴性组〔(110 9± 2 9 8)、(82 1± 2 4 7)、(91 9± 2 9 2 )、(5 9 5± 14 3) μg/L〕(P <0 0 0 1)和健康对照组〔(10 4 9± 16 3)、(6 8 0± 2 7 6 )、(76 3± 2 1 3)、(5 4 3± 7 8) μg/L〕(P <0 0 0 1)。HBVDNA阳性组中 ,上述四项指标随着HBVDNA含量升高而递增。动态观察 2 8例乙肝患者随着治疗过程HBVDNA浓度下降 ,LN、HA、PⅢ、Ⅳ .C的含量明显递减。

丹参及川芎嗪对人成纤维细胞DNA和胶原合成的影响

丹参及川芎嗪对人成纤维细胞ＤＮＡ和胶原合成的影响上海第二医科大学附属新华医院内科（２０００９２）郭传勇，李定国，田字彬，刘树人，王炳芳，陆汉明器官纤维化系由纤维结缔组织弥漫增生所致，参与纤维化形成的细胞主要有成纤维细胞、肌成纤维细胞。成纤维细胞的生长...

人参皂甙Rb_1、Rg_1、Re和Rh_1对人胚肺成纤维细胞非程序DNA合成的影响

应用３Ｈ－ＴｄＲ和１４Ｃ－ＴｄＲ双标记法，液闪测定不同代龄人胚肺成纤维细胞（２ＢＳ）由丝裂霉素Ｃ（ＭＭＣ）诱导的非程序ＤＭＡ合成（ＵＤＳ），以及人参皂甙Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｈ１和Ｒｅ对细胞ＵＤＳ的影响。结果表明，当ＭＭＣ剂量在１０ｎｇ／ｍｌ时，衰老细胞的ＵＤＳ水平下降，而年轻细胞的ＵＤＳ水平显著升高。人参皂甙Ｒｂ１、Ｒｇ１、Ｒｈ１、Ｒｅ均能显著提高衰老细胞的ＵＤＳ水平，且Ｒｂ１、Ｒｇ１作用更明显。