自动化合成生物技术在DNA组装与微生物底盘操作中的应用

基于绿色生物制造进行物质能量生产,有望减少对天然植被、耕地、石化等资源的依赖,而微生物细胞工厂是绿色生物制造过程的“芯片”。合成生物学为微生物细胞工厂的研究提供了重要的使能技术,但目前仍面临生命系统高度复杂、实验过程需要反复试错、实验通量较低等限制因素。自动化合成生物技术借助高通量、自动化和智能化的软硬件设施平台,基于标准化、模块化的生物元件库和合成生物工艺,可低成本、高通量、快速、多循环地完成海量工程试错性实验,加速特定性能人工细胞工厂的设计和优化,支撑相关研究和应用。本文主要针对细胞工厂“设计-构建-测试-学习”循环中最关键、最耗时的“构建”环节,对DNA组装和底盘细胞操作自动化工艺和设施平台进行了总结,对自动化合成生物技术应用于生物合成基因簇挖掘、代谢通路优化和底盘细胞优化的最新进展进行了介绍。最后展望了微生物细胞工厂自动化构建面临的挑战和未来发展,讨论了包括非模式微生物在内的全流程自动化的发展趋势,而自动化装备的国产化自主研发将为此做出重要贡献。

合成生物学中的DNA组装技术探究

研究合成生物学的目的在于通过工程学的研究思路来设计出新的生物系统,或者是改造之前的存在缺陷的生物系统。这是一门新兴的学科,具有较大的发展潜力。从目前的技术发展来看,其在生物医药、农业以及环保等方面发挥着较大的作用。而在合成生物学当中,DNA组装技术是其中的较为关键的一门技术。如果将这门技术发展完善,那么合成生物学技术发展的速度将会更快。因此,对合成生物学中DNA的组装技术进行了简单的探讨,并且研究了其发展的意义和作用。

DNA组装技术的研究进展

合成生物学具有巨大发展潜力,作为一门新兴学科,它有效结合了科学与工程,在生物制药、环保、农业、物质能源等方面发挥了巨大的作用。而DNA组装技术是合成生物学中的关键技术,DNA组装技术研究进展极大的限制了合成生物学的快速发展本文在简述合成生物学发展的基础上,基于DNA组装的基本理念,对主要DNA组装技术发展情况及其在合成生物学发展中的意义及应用进行了研究,为DNA组装技术的应用发展提供参考与借鉴。

自动化DNA组装仪器研制

研制一种高通量自动化的DNA组装仪器,以解决DNA组装过程中通量低、成本高、自动化程度低等问题。通过制作具有高密集度小孔的96孔DNA组装循环加热模块,八连排移液器组件及运动模块,搭建自动化DNA组装仪器;通过软件编写实现温度及移液量的准确控制。经验证DNA组装仪温控性能和移液性能稳定,移液量的重复性为1.23%~7.55%。研制的DNA组装仪可以满足DNA组装实验的移液要求及温度控制要求。

合成生物学中的DNA组装技术

合成生物学旨在应用工程学的研究思路及手段去设计或改造生物系统,是一个综合了科学与工程的拥有发展潜力的新兴学科,在生物医药、农业、能源、环保等方面发挥着巨大作用。DNA组装技术是合成生物学中的关键技术,也是合成生物学快速发展的限制性技术。综述了众多DNA组装技术的发展及其在合成生物学研究中的意义和应用。

利用Gibson DNA组装技术构建人5型腺病毒感染性克隆

为了构建人5型腺病毒（HAdV-5）的感染性克隆,我们使用了Gibson DNA组装技术。设计1对引物用于扩增质粒骨架（包含卡那霉素抗性基因和质粒的复制起点,KAN-ORI）,在引物的5’端添加HAdV-5基因组末端序列（约30NT）和Pac I位点,以携带卡那霉素抗性基因的pShuttle-CMV质粒为模板,PCR扩增得到KAN-ORI片段,该片段的两端均含有约30bp的HAdV-5基因组序列。将KAN-ORI片段与利用野毒扩增纯化的HAdV-5基因组混合,进行Gibson DNA组装反应;反应产物直接转化E.coli感受态细胞,涂布含卡那霉素的LB琼脂平板。挑取菌落,提取质粒,命名为pKAd5。限制性酶切鉴定的结果显示,所鉴定的质粒均含有完整的HAdV-5基因组。使用Pac I酶切线性化pKAd5,利用脂质体转染293细胞,转染4d后单层细胞出现病毒噬斑。拯救的病毒能够在HEp-2细胞扩增;电子显微镜观察呈现典型的腺病毒形态;提取病毒DNA,酶切鉴定的结果与预期的HAdV-5基因组相同,证实HAdV-5得到成功拯救。上述研究结果说明使用Gibson DNA组装技术构建HAdV-5感染性克隆简便易行,为其他DNA病毒基因组的克隆提供了新思路。

DNA组装技术

DNA组装是合成生物学研究的核心技术。随着合成生物学的发展,研究者开发了依赖于DNA聚合酶或DNA连接酶的不同DNA组装技术;为了降低组装成本和便于实现DNA组装的自动化,也发展了一些非酶依赖的DNA组装技术;而几百kb到Mb的大片段DNA的组装则多数依赖于微生物体内重组。文中主要综述了酶依赖、非酶依赖和体内同源重组三类DNA组装技术及其发展情况。

平行四面体纳米孔道中DNA超结构的组装和离子输运特性

受生物膜离子通道结构和功能的启发,人工制备固体纳米孔道门控开关器件一直备受关注.基于仿生纳米孔道的非对称离子传输性质制备的离子二极管和场效应管装置对于构建离子电路和能量转换的纳米器件至关重要.然而,仿生制备的固体纳米孔道在离子传输过程中有漏电流的存在,严重影响了固体纳米孔道应用的灵敏度和信噪比.针对这一问题,研究者利用DNA分子的特殊识别和自组装的功能特性,相继构筑了基于DNA和纳米孔道的智能响应体系.

DNA组装新方法的研究进展

2010年,蕈状支原体Mycoplasma mycoides的人工合成,迎来了合成生物学的崭新时代。这种突破性的进展主要得益于酵母自身强大的DNA体内重组能力。近几年来,除了利用体内重组的DNA大片段拼接技术,基于连接或聚合思想的不同尺度的DNA体外组装方法也相继出现,如Biobrick\Bglbrick、SLIC与Gibson等温一步法等,这些方法的应用加快了合成生物学功能元件库、生物合成途径乃至微生物染色体的人工构建。事实上,目前所建立的各种DNA组装方法,均是由DNA分子拼接理念(包括两分子衔接思想与多片段组装模式)衍生而来。文中将在介绍DNA组装基本理念的基础上,对体内、体外主要的DNA组装方法进行简要梳理,希望为不同类型的合成生物学功能器件及生物合成途径的构造提供参考与借鉴。

基于酿酒酵母的大片段DNA组装与转移技术进展

DNA组装与转移技术是合成生物学的核心使能技术之一,生命体设计改造的复杂度不断提升,使得对大片段DNA组装与转移技术的需求也日益旺盛。小片段DNA的组装与转移技术目前已经比较成熟,大片段DNA由于其分子量大、易断裂,使得体外操作繁琐且效率低下。聚焦酿酒酵母体内组装和转移的技术进展,详细介绍了基于酿酒酵母一次组装和迭代组装的不同方法,并从导入与导出的角度介绍了大片段DNA的转移技术,便于研究者更好地理解和选择酿酒酵母体内组装与转移技术。此外,还展望了将酿酒酵母开发为大片段DNA组装与转移通用平台实现更多物种基因组大尺度设计改造的愿景。

大DNA体内组装技术进展

DNA组装技术是合成生物学的关键共性技术。目前,小分子DNA组装大多采用体外组装策略,而大分子DNA的组装则更多地借助宿主自身的重组机制在体内完成,常用的宿主包括酿酒酵母、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等。本文中,笔者综述了近年来体内大分子DNA组装的研究进展。

DNA合成、组装与纠错技术研究进展

DNA设计合成是推动生命科学及其相关领域发展的关键共性底层技术。常规的遗传操作技术仅能对已有的DNA序列进行有限的改造,而DNA合成技术则可从头“书写”生命信息,从另一高度提升我们对生命体理解、预测和操控的能力。DNA合成技术包括寡核苷酸合成技术、DNA组装技术以及DNA纠错技术。本文总结了以上关键技术的特点和发展趋势,经历超过60年的发展后,化学合成法仍然是当前寡核苷酸合成的主流方法,它被广泛应用于柱式及芯片DNA合成仪,酶法DNA合成技术则有望颠覆传统的DNA化学合成方法;现有DNA合成技术在合成能力和准确性上存在局限,难以直接准确合成基因长度的DNA片段,分级的体外与体内组装技术的合理搭配,可将分段合成的寡核苷酸片段装配成长片段DNA,达到基因长度甚至基因组长度DNA序列的合成,它也因此成为长片段DNA合成的关键;寡核苷酸的合成与组装过程都不可避免地引入错误,基于错配结合或错配切除的纠错技术在DNA合成过程不同阶段的应用,不仅能提高DNA合成的准确性,还可有效降低长片段DNA合成的质控成本。近年来合成生物学等相关领域的迅猛发展,对DNA合成相关技术提出了新的要求,正推动DNA合成、组装与纠错相关技术向着高通量、自动化和集成化的方向不断改进和创新。

一种基于DNA自组装模型求解最大团问题的算法

基于tiles理论模型和已有DNA自组装模型,结合最大团问题给出基于DNA自组装模型的算法设计,得到具体设计初始分子、规则分子和检测分子所需的DAE块种类.在此基础上采用荧光标记和凝胶电泳生物操作提出了一种求解最大团问题算法.该算法设计tiles的种类为Θ(n2+|E|),其生物操作复杂性为Θ(1).此算法降低了实验的复杂度,而且保证了实验的易操作性和结果的准确性。

DNA自组装技术的研究进展及难点(英文)

近年来,DNA自组装成为DNA计算及纳米材料科学等领域研究的热点,它关系着DNA计算机的发展.DNA分子如何组装已成为许多学者关注的焦点.为此,文中主要围绕着DNA分子组装成的初级元件的类型:一条长的DNA单链、多条短寡核苷酸链和自组装单元,重点从自组装的初级元件形成的一维、二维及三维结构上讨论DNA自组装技术与方法.文中讨论了这些技术的原理及应用的研究进展,并且分析了DNA自组装应用于DNA计算的主要难点及解决方案.首先,编码的好坏决定着实验是否能实施;其次,DNA单链之间组装的角度及初级原件之间的连接是影响自组装体产量的关键因素;从具体的实验操作上看,每条DNA单链的浓度比例及退火温度则决定着自组装的成败.随着学科之间的高度交叉,DNA自组装将是材料学、信息学、生物学等领域的重要研究方向,也是推动DNA计算机发展的重要手段.

基于DNA计算自组装模型的Diffie-Hellman算法破译(英文)

DNA自组装计算模型是近年来引人关注的计算模型,已有基于自组装模型的二进制加法、乘法以及有限域中的加法和乘法的讨论.文中利用DNA自组装模型设计的模乘系统,实现了素数p的本原根g连续乘方后模p的数的排列,从而可以在线性时间内求解离散对数,为破译Diffie-Hellman密钥交换算法提供了新的生物方法.该模乘系统使用了Θ(p)种自组装类型,组装的时间复杂度为Θ(p-1).系统最后组装结果提取出报告链后,经过PCR和凝胶电泳读取离散对数结果.该模型扩展了DNA自组装计算模型的应用,为求取离散对数提供了新思路.

自组装DNA计算的研究进展及展望

近年来,许多研究者已经证明二维自组装模型有通用计算能力,同时证明了自组装DNA计算具有可扩展性。随着分子生物学技术的发展,自组装DNA计算有着广阔的应用前景,在纳米科学、优化计算、密码学、医学等众多科学领域中有突破性的创新与应用。较全面地介绍了自组装DNA计算的研究现状、原理、分子结构和数学模型,以及自组装DNA计算的复杂度和误差分析,并对自组装DNA计算待研究的问题和发展前景进行了分析和展望。

DNA逻辑自组装体构建的研究进展

对DNA自组装原理、DNA编码序列设计、DNA自组装基元和自组装体的构建等方面的研究现状进行了述评,提出构建复杂的DNA自组装体仍是该领域的研究难题,未来的研究将主要集中于三方面:1)基于DNA的热力学属性和物理化学属性,建立DNA自组装基元类型库和DNA自组装结构体;2)整合和挖掘高通量的DNA自组装实证数据,以数据为驱动,搭建适合描述DNA自组装体的系统模型;3)进行DNA自组装载药体系的可控性、适应性和应用性分析.

DNA自组装技术及其在电离辐射检测中的应用

电离辐射能够造成DNA分子的损伤(如改变碱基、链断裂和分子交联等)、抑制DNA合成和增强DNA分解等,进而会影响DNA自组装技术构建的纳米结构构型的变化,利用这一性质可用于电离辐射的检测。本文主要介绍了DNA自组装技术在结构和动态两方面的最新进展,并对DNA自组装技术在电离辐射检测中的应用,尤其是DNA拼块自组装纳米结构用于α粒子和β粒子辐照的高灵敏检测器等领域的最新进展进行了综述。

DNA发夹结构自组装信号放大策略应用的研究进展

DNA发夹结构自组装因具有无酶参与、等温以及识别序列能力强等优点,在生物分子和金属离子检测方面展现了良好的发展前景。该文梳理了DNA发夹结构自组装信号放大策略的类型,综述了近年来该策略在致病菌、核酸肿瘤标记物、蛋白质、无机金属离子,以及生物小分子检测中应用的研究进展,并对其未来发展趋势进行了展望,旨在为基于DNA发夹结构自组装检测生物分子提供一定的参考。

基于靶序列循环及DNA长距自组装的电化学传感器用于乳腺癌相关序列c-erbB2的检测

基于"核酸外切酶(ExoⅢ)辅助靶序列循环"和"DNA长距自组装"两种信号放大技术研制了一种DNA电化学生物传感器,并将其用于乳腺癌相关靶序列的高灵敏、高特异性检测。通过将发卡型探针固定在金电极表面,当靶序列存在时,在ExoⅢ的辅助下,发生杂交、酶降解、再杂交的第一重信号放大过程。接着在电极表面加入两条辅助探针,即可发生级联式杂交,形成长距超级"三明治"DNA结构。该结构可吸附大量的电活性分子六氨合钌配合物(RuHex),产生很强的电化学信号,从而实现信号的第二重放大。实验结果表明,在最佳条件下,该传感器的线性范围为10 amol/L^10 pmol/L,检出限达到8 amol/L,而且能较好地识别完全互补和错配序列,有望用于临床实际样本中超低含量靶序列的检测。