不同蔬菜连作对土壤细菌DNA分子水平多态性影响的研究

采用从土壤中直接提取微生物总DNA,并用细菌16SrDNA特异性引物进行PCR扩增、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、克隆和测序等一系列分子生物学手段,研究了不同蔬菜连作对土壤中细菌群落结构的影响。结果表明,采自同一地区的土壤样品,其DGGE图谱的相似性很高;同时蔬菜连作对土壤中细菌的群落组成产生影响,这种影响同蔬菜作物种类和连作年限有关。研究结果还表明,所取土样中的细菌大多数为Proteobacteria类细菌,另外Acidobacteria、Sphingobacteria和Actinobacteria类细菌只占少量比例。

细菌DNA和gm-csf基因对抑制素基因免疫的作用

40只小鼠分为4组,分别注射pC ISI(抑制素质粒)、pC ISI+细菌DNA、pC ISI+pGM-CSF和生理盐水(8.5 g.L-1)。pC ISI剂量为20μg,与佐剂等量混合,2周后加强免疫1次。试验结果表明,细菌DNA佐剂组诱导77.8%(7/9)的个体产生了抑制素阳性抗体,抗体以IgG2α型为主,gm-csf佐剂组产生的抗体以IgG1型为主;基因佐剂联合抑制素基因免疫激发的淋巴细胞增殖能力显著高于抑制素基因单独免疫组(P<0.05);细菌DNA佐剂组阳性鼠的动情期血浆雌二醇高于阴性鼠(P<0.05),免疫对动情期孕酮水平无显著影响(P>0.05)。上述结果表明,细菌DNA和gm-csf能增强抑制素基因的免疫效果。

用三对引物检测血液中细菌DNA的方法学

目的建立稳定、敏感的检测血液中肠源性细菌 DNA的方法。方法取 23例腹部手术后体温 >38.5℃患者的肘静脉血进行血培养，并以酚抽提法提取全血 DNA进行 PCR，靶基因分别为大肠杆菌特异性的β-半糖苷酶基因、脆弱类杆菌特异性的谷氨酰胺合成酶基因，以及大多数细菌所共有的 16SrRNA基因。以标准菌株提取的 DNA为阳性对照，空白对照为阴性对照， 20例健康志愿者全血 DNA为正常对照。对 20例标本重复检测 2次以确定其复现性。结果 PCR复现率为 95％。血培养阳性率为 13.0％（ 3/23）， PCR检测阳性率为 43.5％（ 10/23），较血培养阳性率高（ P=0.016）。结论按照规范进行的 PCR检测血液中肠源性细菌方法稳定，比血培养敏感。

三种细菌DNA及CpG寡核苷酸抗肿瘤免疫的比较实验研究

用大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和双歧杆菌的DNA与CpG寡聚核苷酸 (CpGoligodeoxynucleotides ,CpGODN)对荷瘤鼠进行治疗 ,比较 3种细菌DNA及CpGODN的抗肿瘤免疫作用 ,以筛选最好的细菌DNA及CpG序列用于肿瘤治疗。分别提取 3种细菌DNA并合成 2条CpGODN序列 ,在肝癌HcaFA3细胞株荷瘤小鼠模型上进行免疫治疗 ,以存活期、抑瘤率、NK/Mφ细胞活性及细胞因子 (IFN γ、TNF α、IL 2、IL 12等 )分泌活性等为指标 ,比较 3种细菌DNA之间及CpGODN的抗肿瘤免疫效果。 3种细菌DNA均能使荷瘤鼠的存活期延长 1倍以上 ,但三者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。抑瘤率为 6 4 .0 3%～ 79.5 0 % (P <0 .0 1) ,而CpGODN的抑瘤率为 4 5 %～ 5 1%之间 (P <0 .0 5 ) ,3种细菌DNA以及CpGODN均能显著增强NK细胞和Mφ细胞的杀伤活性 (P <0 .0 5 ) ,但细菌DNA在诱导细胞因子 (IL 2、IFN、TNF等 )以及下调肿瘤细胞端粒酶活性方面 ,CpGODN作用强于细菌DNA。

细菌DNA可显著增强豚鼠接种猪链球菌溶血素的免疫效果

目的 :研究大肠杆菌DNA的免疫增强效果。方法 :用提取的大肠杆菌DNA、合成CpG ODN、弗氏佐剂、蜂胶等不同佐剂分别与猪链球菌溶血素配合 ,免疫 10日龄豚鼠 ,用溶血抑制实验、MTT法和细胞流式技术分别检测豚鼠体液免疫和细胞免疫状态。结果 :经组间单因素相关性分析 ,大肠杆菌DNA、合成CpG ODN和弗氏佐剂均能明显地增强豚鼠特异的体液免疫与细胞免疫 ,其中 ,所用大肠杆菌DNA的刺激溶血抑制抗体的活性与合成CpG ODN相当 (P >0 0 5 ) ,脾淋巴细胞刺激活性与弗氏佐剂相当 (P >0 0 5 )。结论 :所提取的大肠杆菌DNA具有强烈的免疫刺激作用 。

CpG基元在细菌DNA诱导小白鼠THP-1释放细胞因子中的作用

目的 探讨CpG基元在细菌DNA诱导的细胞因子释放中的作用。方法 实验前 1h经腹腔注射 60 0mg/kgD 氨基半乳糖 (D Galactoamine ,D GalN)敏化小鼠 ,采用纯化的大肠杆菌DNA(EscherichiacoliDNA ,ECDNA)、小牛胸腺DNA(CalfthymusDNA ,CTDNA)、含有CpG基元的硫代寡核苷酸 (CpG oligodeoxynucleotides ,CpGODN )和C与G序列颠倒的硫代寡核苷酸 (Non CpGODN )静脉给予小鼠 ,DNA的注射剂量为 3 0mg/kg ,ODN的剂量为 10nmol/只 ,观察ECDNA、DNA、CpGODN与CTDNA、NON CpGODN导致小鼠死亡情况的差异。体外培养THP 1细胞系 ,在THP 1细胞培养体系中加入上述制剂后 ,测定细胞因子TNF α、IL 6、IL 1β的释放情况 ,观察上述制剂诱导细胞因子释放能力的不同。 结果 ECDNA、CpGODN可诱导小鼠的死亡以及细胞因子的大量释放 ,而CTDNA、NON CpGODN则无此能力。结论 含有CpG基元的寡核苷酸具有诱导巨噬细胞大量释放细胞因子的作用 ,CpG基元在细菌DNA诱导的细胞因子释放中具有重要的作用 。

一种快速提取细菌总DNA的方法研究

随着分子生物学技术应用于环境微生物研究的深入开展,占自然界微生物物种总数90％以上的不能人工培养或培养困难的微生物,已经可以借助分子生物学技术进行功能基因的开发和利用。而快速得到纯度较高,结构完整的细菌染色体DNA成为这一技术得以实现的前提。报道了利用高温处理和SDS的裂解作用相结合,而建立的一种快速、简便的提取细菌染色体DNA 的方法。经过脉冲电泳实验证明,利用本方法提取到的几种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株的基因组DNA结构完整,并且无明显降解,无须经过纯化,可以直接进行PCR扩增和酶切等分子生物学操作。将此方法进一步应用于土壤环境DNA的提取方面,同样达到了快速得到大片段、高质量的环境微生物基因组的目的,为研究未培养的环境微生物多样性打下了坚实的基础,同时为环境基因组的提取提供了一个新的途径。

3种方法对临床菌血症样本细菌DNA提取的比较

目的寻找一种简单、有效的提取临床菌血症样本细菌DNA的方法.方法分别用碱液加热裂解法、溶菌酶法和商品DNA提取液法提取细菌DNA,用临床常见病原菌特异性引物,进行PCR扩增.结果 (1)商品DNA提取液法提取革兰阴性菌DNA,经PCR扩增后得到特异性目的片段,但未扩增出革兰阳性菌的特异性目的片段;(2)碱液加热裂解法、溶菌酶法提取革兰阴、阳性菌DNA,经PCR扩增后均得到特异性目的片段,但碱液加热裂解法比溶菌酶法能扩增到更低浓度的细菌DNA目的片段.结论碱液加热裂解法是3种方法中最简单有效的细菌DNA提取方法,适用于临床病原菌基因组DNA提取.

桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的提取及PCR反应体系优化

为了建立一套适用于桑天牛肠道细菌多样性研究的PCR反应体系和程序,采用改良的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法提取桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA,通过L16(45)正交组合试验和单因素梯度试验对MgC l2、dNTP、随机引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR扩增的重要因素进行优化。试验结果表明,采用改良的CTAB方法提取的桑天牛成虫肠道细菌DNA质量较高,适宜于PCR扩增分析。25μLPCR反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer 2.5μL,MgC l22.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,随机引物0.48μmol/L,TaqDNA聚合酶0.75 U,模板DNA 75 ng;退火温度60℃,循环次数30次。

细菌DNA提取方法比较

目的 :比较细菌DNA4种提取方法的优缺点。方法 :采用水煮法、传统法、GenmictionDNAKit法、E .ZNA法分别制备 18种细菌DNA ,比较 4种方法提取DNA纯度及量的差异。结果 :4种方法制备的DNA均可成功应用于PCR扩增 ,水煮法与E .ZNA法提取DNA量都较大 ,但前者纯度低于后者 ;GenmictionDNAKit法提取DNA纯度高 ,但量较低 ;传统法提取的DNA量及纯度均较低 ,但经济、可靠。结论 :4种方法各具特点 ,应根据实验目的选用。

细菌DNA促旋酶和拓扑异构酶IV基因突变与其喹诺酮耐药性的相关性

介绍了喹诺酮类药物在细菌细胞中的作用靶位——Ⅱ型拓扑异构酶(DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ)的组成及其在细菌细胞生长过程中的作用.介绍了测定DNA促旋酶基因(gyrA、gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ基因(ParC、ParE)点突变的常用方法及分析gyrA、gyrB、ParC和ParE突变与细菌喹诺酮耐药性的相关性的常用方法.根据近年来的研究成果,以金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和大肠埃希氏菌、淋病奈瑟氏球菌为代表,概述了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中DNA促旋酶基因和拓扑异构酶Ⅳ基因突变的情况及其与喹诺酮耐药性的相关性,以及喹诺酮类药物对DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ的选择性.

大鼠粪便中细菌基因组DNA提取方法的比较

为获得高质量的肠道细菌基因组DNA,用于研究肠道菌群的多样性,本实验分别采用改良的溶菌酶法和两种试剂盒DNA提取法提取大鼠粪便中的细菌基因组DNA,通过DNA浓度和纯度的测定、PCR-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE技术)对提取效果进行比较,以找到适合于粪便中细菌基因组DNA的提取方法。结果表明,改良的溶菌酶法提取的DNA质量好,纯度高,而且具有菌群多样性丰富等特点,更适合用于肠道微生物菌群后续分子生物学研究。

细菌质粒DNA的快速提取及检测

介绍一种质粒DNA的快速提取方法,所分离出的DNA纯度较好,全部操作仅在两只Eppendorf管中进行,含质粒DNA的上清液可直接点样走琼脂糖凝胶电泳。整个提取过程在较短时间内完成。该方法简便、快捷、效果好。

快速提取细菌DNA方法的研究

目的:研究快速、有效可以应用于压电基因传感器对病原微生物的快速检测的DNA的提取方法。方法:采用沸水浴法,酚、氯仿法,chelex1 0 0法和试剂盒法提取金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3、铜绿假单胞菌ATCC 2 785 3和大肠杆菌ATCC 2 5 92 2的DNA对产物进行纯度和产量测定,并对1 6SrDNA区域利用通用引物进行扩增。初步应用自行研制的压电基因传感器检测金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3的PCR产物。结果:除沸水浴法,其他3种方法均能抽提出3种细菌的DNA与1 0 0法和酚、氯仿法抽提产物的纯度和产量差异无显著性(P >0 .0 5 ) ,但chelex1 0 0法操作更为简单、成本低;试剂盒法抽提出的产物纯度和产量明显高于酚、氯仿法、chelex1 0 0法P <0 . 0 5 ) ,但成本高,操作繁琐。结论:chelex1 0 0法操作简便、省时、成本低,适宜用于压电传感器样本的预处理。

外科手术患者血中细菌DNA的检出率

休克、创伤、长时间肠外营养可能导致肠道细菌移位，应用聚合酶链反应（PCR）技术检测外科病人血中的肠源性细菌DNA国内尚无报道。目的用稳定可靠的PCR方法，检测腹部手术前后血中的以肠源性细菌为主的DNA，并与相关因素进行分析。方法111例择期腹部手术病人在术前，术后第3天、第6天各来血3ml进行检测。患者按手术创伤大小分为三组，又按术后是否存在“全身性炎症反应综合征”（SIRS）分为二组，不同组别与PCR阳性率进行对比。结果术前PCR均为阴性。术后第3天PCR阳性率17．1％（19／11），高于术后第6天PCR阳性率6．3％（7／111），P＝0．004。大手术组PCR阳性率为32.4％（11／34），中手术组为13．4％（9／67），小手术组为10％（1／10），三组之间有差别（P＝0．02）。术后出现SIRS的病人PCR阳性率为43．9％（18／41），高于无SIRS组4．3％（3／70），P＝0．001。结论术后禁食输液治疗病人血中可检出细菌DNA，阳性率与手术创伤大小、术后有无SIRS可能有关。

聚合酶链反应检测肝硬化患者腹水中细菌DNA

目的:探讨PCR方法检测肝硬化患者腹水中细菌DNA的可行性。方法:在细菌16SrRNA基因保守区设计一对通用引物,对7种对照菌株、人基因组DNA、HBVDNA、3 7份肝硬化患者腹水进行聚合酶链反应扩增。结果:7种对照菌株均获得5 3 0bpDNA片段。而与人基因组DNA、HBVDNA无交叉阳性反应,敏感性试验可检测出1pg的细菌DNA。3 7份腹水中有9份获得5 3bpDNA片段,阳性率2 4 3 % (9/3 7) ,而腹水细菌培养阳性率为5 4%(2 /3 7) ,两者比较差异有显著性意义(P <0 0 5 )。结论:将通用引物通过PCR方法扩增细菌16SrRNA基因,具有高度敏感性、特异性,可应用于肝硬化患者腹水中细菌DNA的检测及细菌移位的研究。