人线粒体单链DNA结合蛋白1在恶性肿瘤发生、发展中的作用及研究进展

人线粒体单链DNA结合蛋白1(mitochondrial single-strand DNA-binding protein 1, mtSSBP1)是定位于线粒体中的单链DNA结合蛋白,参与线粒体DNA(mtDNA)的复制、转录和修复,在维持线粒体基因组的稳定性和功能等发挥重要作用。mtSSBP1与肿瘤细胞增殖、转移和侵袭等恶性生物学行为相关,在多种人类恶性肿瘤中表达上调,其与肿瘤组织浸润加深、分化能力减弱、肿瘤增大和临床分期增加均相关。该文现对mtSSBP1的结构、功能及其在不同类型恶性肿瘤中的作用机制进行阐述,旨在为mtSSBP1与肿瘤的基础研究和临床应用提供参考。

基于Transformer-BiLSTM特征融合的DNA结合蛋白预测方法

蛋白质与生命活动密切相关,脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白作为一种特殊的蛋白质,在生命活动中有着不可替代的作用.因此,研究DNA结合蛋白有很重要的现实意义,这个课题的研究前景十分广阔.传统生物技术虽然精度较高,但其成本十分的昂贵,效率比较低,设备要求极高,并不适合现代社会大量研究蛋白质的需求.机器学习的方法在一定程度上弥补了生物实验技术的不足,但是在数据处理方面远不如深度学习技术来的高效与便捷.在本研究中提出了一种基于双向平行长短期记忆神经网络(BiLSTM)和Transformer的深度学习框架来预测DNA结合蛋白.该模型不仅可以进一步提取蛋白质序列的信息和特征,还可以进一步提取进化信息的特征,最后,将这两个特征融合起来进行训练和测试.该模型拓展了研究人员在蛋白质特征提取方面的研究思路,为使用Transformer编码器块提取蛋白质全局特征提供参考.在PDB2272数据集上,与PDBP_Fusion模型相比,精度(ACC)和Matthew相关系数(MCC)分别提高了2.64%和5.51%.该模型的实验结果具有一定的优势.

基于芯片技术探讨结直肠癌中沉默DNA结合蛋白A的基因表达谱分析

目的基于基因芯片技术探讨短发夹RNA沉默人结直肠癌细胞DNA结合蛋白A(dbpA)表达后利用基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析发现与dbpA相关的结直肠癌发生、发展的信号通路。方法选取结直肠癌SW620细胞中表达差异的基因进行深度检测和分析,采用基因芯片技术挖掘差异基因,并运用定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)对芯片结果进行验证,综合分析工具进行GO功能富集分析及KEGG信号通路分析。结果dbpA敲低后基因芯片检测差异表达基因有578条,其中181个基因上调,397个基因下调,显著上调基因有CFL2、C12orf39、EREG、SESN2、CXCL3、CXCL1、VLDVR、DDIT4、INHBE等60个基因,显著下调基因在PRDM10、PCDH19、SRSF8、FGFBP1、TFF2、MTDH、TCF7、EHHADH、WDR77、CEACAM6等60个基因。dbpA敲除后SW620细胞中与肿瘤形成有关的通路主要与“生物过程”有关,包括丝裂原活化蛋白激酶信号通路、癌症途径、NOD样受体信号通路、趋化因子信号通路、粘着斑、基底细胞癌、Wnt信号通路等。基因网络图分析显示有10个基因表达水平下降(FASLG、PDGFA、FGF18、MAP3K7、FGF3、CSDA、NF1、RAP1A、HSPA1A、LAMTOR3等),4个基因表达水平上升(DUSP5、PRAS2、CDC42、DUSP2等),dbpA与MAPK信号通路相关性最大。选择KMAPK信号通路中的5个相关基因即RAPIA、TAK1(MAP3K7)、DUSP5、CDC42、ZAK进行Western blot验证表明,DUSP5表达水平明显上调(P<0.05),RAP1A、TAK1、ZAK表达水平下降,RAP1A、TAK1表达水平下降明显(P<0.05)。dbpA可能通过MAPK通路调节结直肠癌细胞的发生。结论dbpA参与调控的靶基因和信号通路可能为MAPK相关通路,还需要进一步在多细胞和动物实验中研究揭示dbpA下调通路之间的关系及CDC42在结直肠癌发展中的作用。

改良EMSA法分析人α1(Ⅰ)胶原基因序列特异性DNA结合蛋白

目的 :分析人α1( )胶原基因 5′侧翼区具有较高启动调控活性序列的 DNA结合蛋白。方法 :以原代培养人瘢痕皮肤成纤维细胞为胶原产生细胞 ,采用限制性内切酶消化、DNA混合片段末端标记和增强化学发光的改良电泳迁移率改变实验(EMSA)分析人 α1( )胶原基因 5′侧翼区 - 2 6 8～ + 42 bp序列 DNA结合蛋白。结果 :在胶原产生细胞——人瘢痕成纤维细胞中存在 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列的 DNA结合蛋白 ,其结合活性具有特异性 ,并能被 Sp- 1,NF- 1,NF- κB识别序列所竞争。结论 :改良 EMSA法可用于分析较长序列的 DNA结合蛋白 ,人 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列中存在转录因子Sp- 1,NF- 1,NF- κB结合序列 ,这些转录因子结合位点可能与人 α1( )胶原基因 - 2 6 8～ + 42 bp序列的高启动活性有关。

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA的结合蛋白

目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白,探索HCTP4基因的表达调控机制。方法:应用噬菌体表面展示技术,以多聚酶链反应(PCR)技术扩增的HCTP4启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,回收产物并进行克隆化,对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果:噬菌体经富集后,筛选出12个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了与HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合的蛋白有:核糖体蛋白L15、视网膜母细胞瘤结合蛋白8。结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究HCTP4的生物学调节机制,进一步阐明HCV核心蛋白的致病机制奠定了基础。

乙型和丙型肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学基础：启动子DNA结合蛋白研究策略

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染肝细胞之后，首先要借助肝细胞中的一些成分完成其复制和表达的生活周期，主要是肝细胞中的一些调节蛋白与这2种肝炎病毒调节基因序列之间的结合，并对于肝炎病毒的复制和表达过程进行调节。

小鼠α2(Ⅰ)胶原基因DNA结合蛋白研究

目的 :初步分析小鼠α2 ( )胶原基因上游 5′- U TR近端 80 0 bp(- 780～ + 5 4bp)序列的 DNA结合蛋白。 方法 :PCR扩增小鼠α2 ( )胶原基因 - 2 5 8～ + 5 4bp,- 5 19～ - 2 48bp,- 741～ - 5 0 1bp片段 ,Dig- d U TP末端标记 PCR产物 ,与经 SDS- PAGE并转印至膜上的胶原产生细胞的核抽提物进行 DNA -蛋白质结合反应 ,以抗 Dig抗体检测结合反应信号。 结果 : 型胶原基因上游 5′- U TR近端 80 0 bp序列中存在至少 3个不同的核转录因子结合位点 ,相识别 (consensus)的核蛋白因子相对分子质量分别为 12万 ,5万 ,2万。TGF- β1可增强细胞中相对分子质量为 12万的核蛋白因子的表达。结论 :小鼠 α2( )胶原基因上游 - 780～ + 5 4bp这 80 0 bp片段中存在与不同的核蛋白因子结合的序列 ,可能与 Sp- 1有关。TGF- β1通过增强相对分子质量为 12万核蛋白的表达而促进该蛋白与靶调控序列的结合。

应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白

目的:通过筛选HBsAg基因启动子Ⅰ(SP Ⅰ,surface promoter Ⅰ)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径. 方法:应用噬菌体展示技术,以HBsAg基因启动子Ⅰ的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索. 结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的14个克隆中得到8 个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV表面抗原基因启动子Ⅰ特异结合的肝细胞蛋白,共编码7种蛋白.其中3个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白. 结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBsAg基因启动子Ⅰ的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因.

一个能与水稻未成熟种子核蛋白特异结合的31bp的DNA片段

水稻蜡质基因5'上游序列中有5个能与水稻胚乳核蛋白结合的片段，其中HinfId和RsaIe片段有部分重叠，而重叠部分含AACGT顺序。按重叠区上下游顺序合成了其中含有3次重复的AACGT顺序的31bp寡核苷酸，并以此为探针进行凝胶滞后实验，表明它不仅能与未成熟水稻种子的胚乳核蛋白特异结合，而且也与HinfId和RsaIe片段有强烈的竞争作用。因此31bp顺序中含有与水稻胚乳核蛋白专一结合位点，从而有可能应用此31bp的寡核苷酸作探针来分离编码蜡质基因的调控蛋白基因。

鸡减蛋综合征病毒DNA结合蛋白的基因结构及同源分析

从中国发病鸡群中分离的鸡减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）ＡＡ－２株，经常规方法提取其病毒核酸后，构建了限制性内切酶ＰｓｔⅠ及ＨｉｎｄⅢ水解片段的基因文库。对其中ＨｉｎｄⅢ－Ｆ片段（５２．９～５８．９ｍｕ）的正反２条链的序列测定发现，其反链存在１个编码容量为３８７个氨基酸（ａａ）的开放读码框架（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），经Ｇｅｎｅｂａｎｋ／ＥＭＢＬ同源搜寻后证实其编码产物为ＥＤＳＶ的ＤＮＡ结合蛋白（ＤＢＰ）。与其他腺病毒ＤＢＰ的氨基酸序列进行同源比较，其Ｎ端同源性在１９．０％～４６．２％之间，Ｃ端同源性在２７．７％～６０．４％之间。腺病毒ＤＢＰ的３个保守序列ＣＲ１，ＣＲ２，ＣＲ３在ＥＤＳＶＤＢＰ中有较大变化，但ＥＤＳＶＤＢＰ的锌指框架（Ｚｎ２＋ｆｉｎｇｅｒｍｏｔｉｆ）却保留了对其功能必需的残基。

大鼠骨骼肌肌质网序列非依赖性的DNA结合蛋白

目的：观察大鼠骨骼肌肌质网上是否存在非核ＤＮＡ结合蛋白。方法：应用差速离心及蔗糖密度梯度离心法分离大鼠骨骼肌肌质网膜蛋白，用３２Ｐ标记的ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ印记杂交。结果：在大鼠骨骼肌肌质网膜中存在两种ＤＮＡ结合蛋白，相对分子质量分别是８３０００、５８０００，这２种蛋白质可与不同的线状双链ＤＮＡ，环状ＤＮＡ及单链ＤＮＡ结合。

DNA结合分化抑制蛋白1和基质金属蛋白酶9在结直肠癌中的表达及与微血管密度的相关性

目的探讨结直肠癌组织中DNA结合分化抑制蛋白1(Id-1)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达及其与肿瘤微血管生成、临床病理指标的相关性。方法应用免疫组织化学染色法检测50例结直肠癌组织和50例癌旁正常组织中Id-1和MMP-9的表达,以及CD34标记的微血管密度(MVD)情况。结果 Id-1和MMP-9在结直肠癌组织中阳性表达为72.00%(36/50)、78.00%(39/50),显著高于癌旁正常组织的24.00%(12/50)、28.00%(14/50)(P=0.000);结直肠癌组织中MVD值为17.22±2.08,明显高于癌旁正常组织5.36±2.17(P=0.000);Id-1、MMP-9和MVD均与肿瘤浆膜浸润、TNM分期、癌胚抗原(+)、脉管浸润、淋巴结转移及肝转移相关(P均<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度无关(P均>0.05);癌组织中Id-1和MMP-9阳性表达组MVD值显著高于阴性组(P均=0.000);结直肠癌组织中Id-1与MMP-9呈明显正相关性(r=0.429,P=0.000);生存分析显示:Id-1与MMP-9表达与结直肠癌患者预后关系密切,二者高表达提示预后不良。结论 Id-1、MMP-9高表达与结直肠癌的发生演进高度相关,并与MVD呈正相关,二者可能共同参与了肿瘤微血管的生成、肿瘤的浸润及血行转移。

8-Br-cAMP和槲皮素诱导Eca-109细胞p16基因启动子DNA结合蛋白的定位研究

目的 :探讨 8 Br cAMP和槲皮素 (quercetin)诱导的Eca 10 9细胞p16基因启动子特异性结合的序列特异性DNA结合蛋白 (DBP)的定位。方法 :应用DBP定位改进方法 ,以制备的特异性DNA探针检测目的DBP在细胞内的定位 ;以免疫细胞化学技术 ,检测细胞PCNA免疫反应性 ,作为肿瘤细胞恶性程度生物标志。结果 :DBP定位信号以胞核为主 ,胞质有阳性信号的细胞 ,胞膜也呈阳性信号 ;2实验组信号比对照组强 ;各组信号均以大细胞更强 ;PCNA免疫细胞化学阳性呈棕黄色颗粒 ,主要位于胞核 ,对照组强于实验组。各组均以大细胞阳性信号更强。结论 :2实验组与p16基因启动子结合的DBP主要位于胞核 ,但核外存在结合潜力的蛋白质。 2实验组PCNA免疫反应性均下降。提示这些与p16基因启动子区结合的DBP在一定程度上可诱导细胞恶性逆转化。

原位DNA结合蛋白显示技术的改进

目的 :探讨DNA结合蛋白定位技术的改进。方法 :以左旋咪唑 /酒精先消除细胞的内源性碱性磷酸酶(AP) ,再分别以DNase和RNase消除细胞内源性核酸 ,应用低盐浓度的杂交液预杂交后再加特异DNA的标记探针 ,以链霉亲和素SA AP中介 ,最终以四氮唑盐 /5溴 4 氯 3 吲哚磷酸 (NBT/BCIP)作为底物 ,37℃下显色。结果 :DBP阳性信号呈紫色细颗粒 ,主要定位于胞核。结论

番茄丛矮病毒组(Tombusviruses)成员外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白

应用South-western技术以番茄丛矮病毒组(tombusvirus)6种病毒为材料研究了它们的外壳蛋白对单双链DNA的结合作用。结果表明tombus-组6种病毒(PLCV,AMCV,CNV,CyRSV,PAMV,TBSV)的外壳蛋白及PLCV重组外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白,对单链DNA的结合能力远远超过双链DNA。这种结合作用可能与在tombus一组病毒外壳蛋白立体空间结构有关,因为当蛋白变性时结合作用大大降低。另外,一旦外壳蛋白与单链DNA发生相互作用,用4moL/L尿素或0.1％SDS在90°C水浴中难以洗掉。Tombus一组病毒外壳蛋白这种对单双链DNA的结合作用可能表明它们是一种参与病毒体内运输或调节复制的蛋白。

应用噬菌体展示技术筛选细胞周期素B2启动子DNA的结合蛋白

目的筛选细胞周期素B2(cyclinB2)启动子DNA结合蛋白,探索cyclinB2的表达调节机制。方法应用噬菌体展示技术,以cyclinB2启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附洗脱扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果噬菌体经富集后,筛选出20个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和cyclinB2启动子特异结合的肝细胞蛋白,共编码6种已知蛋白。结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到cyclinB2启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究cyclinB2基因的转录调节机制奠定了基础。

非同位素法分析序列特异性DNA结合蛋白的三种方法

目的为在转录调控水平研究蛋白质异常表达机制,利用核转录因子与相应DNA调控序列特异结合的原理,非同位素法分析细胞内序列特异性DNA结合蛋白。方法凝胶滞留实验(EMSA)采用Dig-ddUTP末端标记DNA,核蛋白粗提或纯化产物与之液相结合后,PAGE分离核蛋白并转印至尼龙膜,化学发光法检测结果,Southwestern分析方法首先采用SDS-PAGE分离核蛋白粗提或纯化产物,蛋白转印至膜上后与Dig-dUTP末端标记的DNA杂交,酶免疫学检测结果,磁性DNA结合蛋白纯化法则将靶DNA与商品化磁性DNA粒子相连,用不同的连接、洗脱条件得到序列特异性靶DNA结合蛋白,银染显示核蛋白纯化结果。结果 EMSA中由于游离DNA与DNA-蛋白复合物有不同电泳迁移率,出现滞后DNA条带提示有识别该特定DNA序列的核蛋白存在,Southwestern分析除能提示核抽提物中有无可与DNA结合的核蛋白外,还提示其中核蛋白分子质量,核蛋白粗提物经磁性DNA亲和层析后DNA结合蛋白在银染时出现较纯的特异识别该DNA序列的核蛋白条带。结论 EMSA,Southwestern分析及磁性DNA层析是3种实用的研究DNA结合蛋白的方法,配伍应用具有简便、重复性好、敏感性和特异性高、无同位素污染等优点,是转录调控水平研究疾病相关基因异常表达的有效方法。

HBsAg基因启动子Ⅰ DNA结合蛋白1下调IL-18基因启动子

目的:研究HBsAg基因启动子I DNA结合蛋白1(SBP1)与白介素-18(IL-18)基因表达的关系,研究SBP1在HBV致病的分子生物学机制中的作用. 方法:构建质粒pcDNA3.1(-)-SBP1,pCAT3-IL-18,转染HepG2细胞进行表达,应用酶联免疫黏附法(ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性. 结果:构建的表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1经过序列分析和酶切鉴定正确.真核表达载体pcDNA3.1(-)-SBP1和pCAT3-IL-18P共转染的HepG2细胞的pCAT表达活性是pCAT3空载体的0.37倍,是转染pCAT3-IL-18P的0.17 倍,抑制率达到86.32%. 结论:SBP1可以下调IL-18启动子的活性,抑制IL-18基因的表达.

噬菌体展示技术筛选诱导型NOS基因启动子DNA结合蛋白的研究

目的筛选诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子DNA结合蛋白,探索iNOS基因的表达调控机制。方法应用生物信息学方法确定iNOS基因启动子序列,以PCR扩增iNOS基因启动子DNA片段,构建真核报告载体pCAT3iNOSp,并转染HepG2细胞系,用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性以明确所得到的DNA片段具有启动子活性;以iNOS基因启动子片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附洗脱扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和蛋白质同源性生物信息学搜索。结果pCAT3iNOSp瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3Basic空载体的4.2倍,说明所得到的DNA片段具有启动子活性;噬菌体经富集后,筛选出12个阳性克隆,成功获得了iNOS基因启动子的DNA结合蛋白编码序列。结论所构建的iNOS基因启动子具有顺式激活下游基因表达的作用;筛选得到的iNOS启动子DNA结合蛋白对于研究iNOS基因的转录调节机制具有重要意义。

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白

目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白,探索NS5A-TP9的表达调节机制。方法:应用噬菌体展示技术,以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,回收产物构建克隆载体,对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果:噬菌体经富集后,筛选出10个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有:补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和α1微球蛋白。结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制,进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础。