黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响

目的探讨黄精多糖对衰老小鼠肝线粒体呼吸链酶及DNA聚合酶γ表达的影响。方法选用昆明小鼠,用D-半乳糖致成亚急性衰老模型,并观察药物对小鼠呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ的活性及DNA聚合酶γmRNA的表达。通过RT-PCR法检测衰老小鼠肝线粒体中DNA聚合酶γ基因在mRNA水平的变化。结果黄精多糖可提高衰老小鼠呼吸链酶活性,降低DNA聚合酶γmRNA的表达。结论黄精多糖可以通过改善肝线粒体能量代谢,使DNA聚合酶γmRNA表达减少,提高呼吸链酶复合体Ⅰ、Ⅱ+Ⅲ而起到延缓衰老的作用。

中国生育男性DNA聚合酶γ基因CAG三核苷酸重复及与特发性男性不育的相关性研究

目的:分析中国特发性男性不育患者与正常男性DNA聚合酶γ(Polg)基因CAG三核苷酸重复,探讨CAG三核苷酸重复序列多态性与男性不育的关系。方法:应用PCR结合基因扫描(GeneScan)分型技术,对104例正常对照与55例弱精子症患者、57例少精子症患者、34例无精子症患者进行Polg基因分型。结果:弱精子症患者10/not10基因型比例大于其他各组,但统计学分析差异无显著性。结论:首次提示Polg基因CAG三核苷酸重复数目在欧洲和中国正常男性中可能存在人种差异,而10/not10基因型与精子运动障碍的关系需进一步研究。

雷帕霉素对肝脏缺血再灌注中线粒体DNA聚合酶γ的调控作用

目的研究大鼠肝缺血再灌注损伤中mtDNA聚合酶γ的表达情况,以及雷帕霉素对其的调控作用。方法 SD大鼠60只,制作大鼠肝脏缺血再灌注模型,分四组:A组:肝脏缺血30min无干预组;B组:缺血50min无干预组;C组:缺血50min雷帕霉素干预组;D组:假手术组。分别于术后24h、第3天、第5天处死各组大鼠,取肝组织进行病理检测;采用RT-PCR检测mtDNA聚合酶γmRNA的表达。结果 C组肝组织病理损害和mtDNA聚合酶γmRNA表达明显低于B组(P<0.01),术后A组、B组mtDNA聚合酶γmRNA的表达逐渐降低,C组则一直维持在同一水平。结论雷帕霉素能够减轻肝脏缺血再灌注损伤,抑制HIRI中mtDNA聚合酶γmRNA的过度表达,从而对肝脏缺血再灌注损伤起保护作用。

DNA聚合酶γ介导的口腔鳞癌细胞放疗增敏

目的:研究mtDNA损伤修复蛋白POLG的表达调控与γ射线不敏感的口腔鳞状细胞癌细胞(OSC-5)的凋亡损害的相关性。方法:体外培养OSC-5细胞,并用30Gyγ射线处理,MTT比色法检测OSC-5细胞存活率,RNA干涉技术敲除POLG基因,Western Blot检测POLG和Cleaved-PARP蛋白的表达。结果:30Gyγ射线处理后OSC-5细胞的增殖率为(75.67±4.16)%;si-POLG下调OSC-5细胞POLG蛋白表达水平;si-POLG转染的细胞经γ射线处理后Cleaved-PARP蛋白表达增加,细胞存活率下降(P<0.05)。结论:通过抑制口腔鳞状细胞癌细胞mtDNA损伤修复蛋白POLG能增加对γ射线不敏感的OSC细胞的凋亡损害。

DNA聚合酶γ基因突变研究进展

DNA聚合酶γ(polγ)是已知DNA聚合酶中唯一位于线粒体并参与线粒体DNA复制与修复的酶。POLG的突变可导致其编码的polγ功能异常,从而使线粒体DNA的复制发生障碍,影响线粒体的功能,引起线粒体相关的疾病。目前已发现POLG1基因的致病性突变多达130种,可导致Alpers综合征、渐行性眼外肌麻痹等线粒体疾病。现从DNA聚合酶γ的分子结构及其在线粒体DNA复制与修复中所起到的作用,阐述POLG突变与线粒体疾病的关系,并简要介绍几个常见的突变位点。

DNA聚合酶γ的提取、纯化和鉴定

目的:提取并纯化人宫颈癌细胞(HeLa)的线粒体DNA聚合酶γ(DNA polymeraseγ,Polγ),鉴定其纯度和活性.方法:运用离子交换层析等方法提取纯化HeLa细胞的线粒体Polγ,并用Bradford法检测蛋白浓度.经SDS-PAGE检测蛋白纯度和相对分子量,Western blotting验证蛋白.用α-^(32)P- dTTP掺入法,液体闪烁计数器进行放射性测量以确定Polγ的活性.结果:成功提取并纯化HeLa细胞的线粒体Polγ,经SDS-PAGE鉴定,有一个大约140 kDa的亚基单位,Western blotting证实为Polγ.对其进行150倍纯化,收得率为6%,酶的总活力为4.81 U,比活力为36.17 U/mg.结论:HeLa细胞的线粒体Polγ通过离子交换层析法提取和纯化后活性较高,可用于体外药物线粒体毒性的检测.

血清中DNA聚合酶α在阿尔茨海默病中的表达和诊断价值分析

目的探究血清中DNA聚合酶α(DNA polα)在阿尔茨海默病(AD)中的表达水平,分析其在AD中的诊断价值。方法选取2019年3月至2023年4月在首都医科大学宣武医院就诊的AD痴呆(DAT)期患者100例作为DAT组,轻度认知障碍(MCI)期患者43例作为MCI组;同期,选取68例同年龄组别的健康者作为HC组。检测各组血清样本中DNA polα的表达水平,利用受试者工作特征(ROC)曲线分析DNA polα在AD中的诊断价值。结果DAT组血清DNA polα表达水平高于MCI组(P<0.05)和HC组(P<0.001),随着AD病程发展,DNA polα表达水平有递增趋势。DNA polα表达水平与简易智能精神状态检查量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分均呈负相关(r=-0.1553、-0.2037,P<0.05)。DNA polα诊断DAT期的曲线下面积(AUC)为0.682,灵敏度为0.900,特异度为0.412;DNA polα诊断MCI期的AUC为0.546,灵敏度为0.977,特异度为0.250;DNA polα鉴别诊断MCI期和DAT期的AUC为0.664,灵敏度为0.780,特异度为0.535。结论DNA polα在DAT期AD患者中表达水平升高,且其表达水平与AD病程发展存在一定联系,推测DNA polα有可能是诊断AD潜在的血液生物标志物。

Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

DNA聚合酶θ:易错的多功能DNA末端修复分子

DNA聚合酶θ(DNA polymerase theta,Polθ)是一种广泛存在于动植物中的DNA修复酶。它在选择性末端连接(alternative end-joining,Alt-EJ)途径中发挥着关键作用,常参与DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)损伤修复。在正常生理状态下,Polθ主要调控基因组稳定性。然而,在恶性肿瘤发生时,Polθ表现出异常高表达水平,并参与调控肿瘤细胞的恶性转变过程。研究表明,抑制Polθ活性可导致同源重组(homologous recombination,HR)缺陷的肿瘤细胞发生合成致死(synthetic lethality,SL)。因此,已经开发出多种针对Polθ的小分子抑制剂,可与其他化疗药物联合使用以抑制恶性肿瘤的发展。此外,敲除或抑制Polθ活性还能增加HR修复效率,从而提高外源基因靶向整合效果。本文综述了Polθ及其介导的Alt-EJ修复机制在生物学功能方面的最新研究进展,为靶向Polθ在肿瘤治疗和基因编辑方面的应用提供理论基础。

DNA聚合酶η小分子抑制剂筛选

DNA损伤修复以及基因组稳定性维持对于动植物正常生长和防御逆境至关重要。针对DNA聚合酶错误掺入导致的基因组不稳定性,本研究以DNA聚合酶η为研究对象,通过计算分子模拟对接的方式,对其可能的小分子抑制剂进行筛选,并对其酶动力学参数进行测定。结果显示:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate,d ATP)对DNA聚合酶η的活性具有抑制效果,使其延伸的相对效率为36%~42%。分子模拟对接和体外实验结果表明,相较于dATP(亲和力为-26.7 kJ/mol),环鸟苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)与DNA聚合酶η具有更低的结合能(亲和力为-35.1 kJ/mol)。酶动力学参数测定结果也表明,相较于dATP,cGAMP具有更强的抑制能力且在浓度为0.5 mmol/L时达到最强(相对延伸效率为13%)。因此,本研究筛选获得了针对DNA聚合酶η的一种潜在的小分子抑制剂。同时,鉴于该蛋白质高表达导致细胞对抗肿瘤药物(DNA损伤剂)的耐受性,这为新型药物的开发提供了依据。

DNA聚合酶θ的合成致死作用研究

利用合成致死(SL)作用治疗癌症可能会成为一种有效且对患者安全的方案。在诱导合成致死效应的众多因素中,参与DNA修复的因素是最密切相关的。当一个经典的DNA双链断裂(DSB)修复途径发生突变时,替代途径可能是消除肿瘤细胞的靶标。目前,抑制缺乏经典修复途径肿瘤细胞中的RAD52和/或PARP1一直是诱导合成致死作用的潜在靶标,但是,常用的PARP1抑制剂(PARPi)的耐药性是制定治疗方案的最大障碍。由POLQ基因编码的DNA聚合酶θ(Polθ)介导的末端连接(TMEJ)在另一种DSB修复途径起关键作用。因此,它是治疗具有同源重组修复(HRR)缺陷肿瘤的潜在靶点,抑制其活性可以诱导SL。在本综述中,主要讨论了基于靶点Polθ合成致死性的抗癌疗法的现状。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

Pfu-sso7d DNA聚合酶的制备及反应缓冲液的研究

目的:制备有高效扩增长片段以及复杂片段能力的Pfu DNA聚合酶。方法:运用基因工程学方法构建重组质粒pET-28a-Pfu-sso7d,采用优化后的诱导条件对pET-28a-Pfu-sso7d实行诱导表达,将菌液超声破碎并提取上清液,应用镍亲和层析洗脱纯化取得较纯Pfu-sso7d DNA聚合酶。采用qPCR方法对酶进行酶活力单位定量、确定反应缓冲液组分最佳浓度及检测自制Pfu-sso7d DNA聚合酶酶活性。结果:在1 mmol·L^(-1) IPTG、16℃条件下诱导Pfu-sso7d DNA聚合酶菌液16 h,Pfu-sso7d DNA聚合酶高效表达;用20~100 mmol·L^(-1)咪唑可将蛋白洗脱。Pfu-sso7d DNA聚合酶最终活力单位定量为1 U·μL^(-1)。PCR最佳反应缓冲液为pH9.0、20 mmol·L^(-1) Tris-HCl、0.6 mmol·L^(-1) MgSO_(4)、50 mmol·L^(-1) KCl、5 mmol·L^(-1)(NH_(4))_(2)SO_(4)、0.1%Triton X-100,添加剂组分为3%DMSO、1 mol·L^(-1)甜菜碱。Pfu-sso7d DNA聚合酶能高效扩增3000 bp的目的条带,活性达到商用高保真DNA聚合酶水平。结论:基于基因重组制备的Pfu-sso7d DNA聚合酶可进行高效的PCR反应,节省了实验室PCR成本,为进一步提高Pfu DNA聚合酶活性提供一定技术参考。

重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化

Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量,以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标,通过单因素实验优化产生TaqDNA聚合酶含量的单因素:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量,结果表明:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度,对该基因工程菌发酵产Taq DNA聚合酶的比酶活力有显著影响,而诱导培养时间、接种量对产Taq DNA聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺,响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为:IPTG诱导剂浓度>发酵温度>pH值,最佳发酵工艺参数为:发酵温度37.2℃,pH值为7.5,IPTG诱导剂浓度为0.800 mmol/L,在此条件下发酵,Taq DNA聚合酶比活力达到(43.822±0.878)kU/mg。

HBV DNA聚合酶在介导HBV相关肝细胞癌肿瘤细胞免疫逃逸中的作用

目的本研究旨在明确HBV DNA聚合酶是否与T淋巴细胞功能衰竭相关,进而介导HBV相关肝细胞癌(HCC)肿瘤细胞的免疫逃逸以及探寻具体的分子机制。方法稳定转染带有Flag标签的HBV DNA聚合酶表达质粒(FlagHBV-P)和细胞间黏附分子-1(ICAM1)的肝癌细胞系Huh7、HepG2与Jurkat细胞共培养,MTT、qRT-PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)实验分别检测Jurkat细胞增殖、活化(CD69表达)以及细胞因子IFN-γ分泌情况。RNA-seq筛选稳转细胞系与对照细胞中表达差异的免疫相关分子,mRNA半衰期及蛋白半衰期实验确定HBV DNA聚合酶对免疫相关分子具体在何种水平产生影响。网站预测此免疫相关分子启动子区域可能结合的转录因子,Western Blot实验验证转录因子对免疫相关分子的影响,挽救实验确定HBV DNA聚合酶是否通过此转录因子影响免疫相关分子的表达水平。两组间比较采用成组t检验。结果与对照组相比,实验组细胞(Huh7、HepG2)增殖、活化及细胞因子分泌明显降低(P值均<0.01)。与对照细胞相比,实验组细胞(Huh7、Hep G2)的ICAM1 mRNA和蛋白水平均降低(P值均<0.01)。网站预测ICAM1启动子并初步筛选锚定了NFKB1、RELA和STAT3。与对照组相比,实验组细胞(Huh7、Hep G2)p65蛋白的表达水平明显降低(P值均<0.01)。过表达p65后,ICAM1蛋白表达水平明显升高,降表达p65后,ICAM1蛋白表达水平明显降低(P值均<0.01),挽救实验中过表达p65后,对照组与实验组细胞的ICAM1表达水平无明显差异(P值均>0.05)。过表达ICAM1后,对照组与实验组细胞(Huh7、Hep G2)的增殖、活化及细胞因子分泌无明显差异(P值均>0.05)。结论HBV DNA聚合酶通过抑制NF-κB中p65的表达来下调ICAM1的水平以介导HCC免疫逃逸。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

四种DNA聚合酶扩增效果的比较

目的比较及评价不同品牌的DNA聚合酶的扩增效果,为筛选性价比高的酶提供参考。方法本实验选用四个品牌的DNA聚合酶,设定不同的模板浓度、产物长度、退火温度等进行PCR扩增,扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。结果四个品牌的聚合酶通过灵敏度检测的检测下限都在10 pg/μl以下,退火温度在55~65℃范围都能扩增出目的条带,对退火温度的适应范围比较广。品牌4扩增出的目的条带最多,扩增范围最广;品牌2电泳条带最明亮,扩增能力最强;品牌1条带最单一,扩增特异性最好。结论四个品牌的酶在灵敏度、扩增长度、退火温度范围、扩增时间等方面都有一定差异。品牌2扩增能力最强,性价比最高,更适合工业领域。

常见DNA聚合酶γ基因突变和线粒体疾病

DNA聚合酶是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶γ(polγ)存在于人类线粒体中,它是线粒体DNA复制和修复所必须。DNA聚合酶γ基因(POLG)发生突变后会导致其编码的polγ功能发生改变,使线粒体DNA(mtD-NA)复制及线粒体氧化磷酸化等功能障碍,引起线粒体相关疾病。对这些突变位点及其与疾病关系的研究为线粒体疾病的发病机制及治疗等提供了线索。本文对一些POLG常见位点突变相关研究进行了综述。

DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响

背景与目的:变性高效液相色谱(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,DHPLC)是最近发展起来的一种灵敏而高通量的基因突变检测技术,在工作中我们发现某些因素,尤其是DNA聚合酶干扰DHPLC分辨力。本文详细地分析了具校正功能和非校正功能的DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响,旨在寻找更适合DHPLC分析的DNA聚合酶。方法:选择长度为268bp、317bp、590bp的3个代表性的片段用于DHPLC分析。选择6种品牌的TaqDNA聚合酶,1种Ampli-TaqgoldDNA聚合酶,4种具校正功能的DNA聚合酶(Pfu和Vent),用这11种酶扩增同一DNA片段,并进行DHPLC检测,分析并鉴定它们对DHPLC峰型的影响。结果:TaqDNA聚合酶对DHPLC分析产生两种明显的负面影响。一是在DHPLC图谱的主峰前,形成一个额外小峰,影响DHPLC对杂合双链的分辨能力。另一种影响是难以形成正常的DHPLC色谱图,导致DHPLC检测的失败。具校正功能的DNA聚合酶和TaqgoldDNA聚合酶对DHPLC几乎不产生这些负面影响。结论:具校正功能的DNA聚合酶比Taq聚合酶更适合于DHPLC突变或SNP分析,尤其是GC含量高的小片段或其它容易受干扰的片段应首选PfuDNA聚合酶用于DHPLC分析。