聚ADP-核糖聚合酶-1在喉鳞状细胞癌细胞DNA氧化损伤及凋亡中的作用

目的探究聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP1)在喉鳞状细胞癌(LSCC)中的表达及其对LSCC细胞DNA氧化损伤与凋亡的影响。方法收集40例患者的LSCC组织及癌旁组织样本,采用免疫组化染色和qRT-PCR检测LSCC组织与癌旁组织中PARP1的表达。采用不同浓度Menadione诱导LSCC细胞系Hep-2,MTT法检测不同浓度诱导下细胞增殖抑制率。将Hep-2细胞随机分为对照组(正常培养)、Men组(20μmol/L Menadione处理)、Men+PARP1抑制剂组(20μmol/L Menadione+10μmol/L PARP1抑制剂Olaparib共处理)。MTT法计算各组细胞增殖抑制率;流式细胞术检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;细胞免疫荧光染色观察各组细胞DNA损伤标记分子γ-H2AX焦点生成情况;Western blot测定各组细胞γ-H2AX、DNA-PKcs、BRCA1、LIG4、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达;Hoechst33258染色观察各组细胞凋亡情况。结果LSCC组织中PARP1阳性表达率及PARP1 mRNA表达均明显高于癌旁组织(P<0.01)。Hep-2细胞经不同浓度Menadione诱导后,细胞增殖抑制率均升高(P<0.05)。与对照组比较,Men组和Men+PARP1抑制剂组的细胞增殖抑制率升高,细胞ROS水平升高,γ-H2AX焦点形成明显增加,γ-H2AX蛋白表达上调,DNA-PKcs、BRCA1、LIG4蛋白表达均下调,细胞出现浓缩、碎裂的蓝色凋亡体,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05),且Men+PARP1抑制剂组以上变化较Men组更明显(P<0.05)。结论PARP1在LSCC组织中高表达,抑制其表达能够进一步加重Menadione诱导的Hep-2细胞DNA氧化损伤,并促进细胞凋亡。

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1-polβ的构建

目的 :构建含突变型 polβ基因重组表达载体。 方法 :从食管癌标本中提取总RNA ,反转录合成cDNA ,克隆入 pCDNA3.1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒 ,并进行测序。 结果 :测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论 :成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体 ,可应用于下游研究。

DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响

背景与目的:变性高效液相色谱(denaturinghigh-performanceliquidchromatography,DHPLC)是最近发展起来的一种灵敏而高通量的基因突变检测技术,在工作中我们发现某些因素,尤其是DNA聚合酶干扰DHPLC分辨力。本文详细地分析了具校正功能和非校正功能的DNA聚合酶对变性高效液相色谱在基因突变检测中的影响,旨在寻找更适合DHPLC分析的DNA聚合酶。方法:选择长度为268bp、317bp、590bp的3个代表性的片段用于DHPLC分析。选择6种品牌的TaqDNA聚合酶,1种Ampli-TaqgoldDNA聚合酶,4种具校正功能的DNA聚合酶(Pfu和Vent),用这11种酶扩增同一DNA片段,并进行DHPLC检测,分析并鉴定它们对DHPLC峰型的影响。结果:TaqDNA聚合酶对DHPLC分析产生两种明显的负面影响。一是在DHPLC图谱的主峰前,形成一个额外小峰,影响DHPLC对杂合双链的分辨能力。另一种影响是难以形成正常的DHPLC色谱图,导致DHPLC检测的失败。具校正功能的DNA聚合酶和TaqgoldDNA聚合酶对DHPLC几乎不产生这些负面影响。结论:具校正功能的DNA聚合酶比Taq聚合酶更适合于DHPLC突变或SNP分析,尤其是GC含量高的小片段或其它容易受干扰的片段应首选PfuDNA聚合酶用于DHPLC分析。

食管癌高发区人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的 :研究林州市食管癌高发区病例的食管癌组织中DNA聚合酶 β基因 (polβ)的突变情况。 方法 :利用PT PCR、SSCP和序列分析对食管癌高发区 5 0例食管癌及癌旁组织标本中polβ基因进行检测。 结果 :5 0例食管癌标本中有 2 2例 polβ发生变异 ,突变率为 4 4 % (2 2 /5 0 ) ;而癌旁组织仅 2例异常 ,突变率为 4 % (2 /5 0 )。突变形式有 :5 8bp(177位到 2 34位 )的基因片段缺失 ;375位A→G(Ile→Val) ,4 5 4位T→C(Phe→Ser) ,4 6 2位G→T(Glu→终止码 ) ,4 6 6位G→A(Gly→Glu) ,6 13位A→T(Lys→Ile) ,6 4 8位G→C(Gly→Arg) ,6 6 0位A→G(Arg→Gly)。结论 :食管癌高发区食管癌组织存在 polβ基因突变 ,且突变率较高 ;该酶基因突变可能与食管癌的发生。

脑胶质瘤组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的:研究人脑胶质瘤组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况。方法:应用RT-PCR及SSCP检测22例脑胶质瘤、4例脑膜瘤、3例垂体瘤及1例肺部转移性鳞癌标本中polβ的表达,利用DNASIS、OMIGA软件及Chou&Fasman算法对扩增产物进行序列分析及蛋白质二、三级结构分析。结果:脑胶质瘤组织中DNApolβ突变率为6/22,共8个突变位点,2例发生504位A→G(131位Lys→Glu)、748位A→G(212位His→Arg)突变,2者蛋白质二级结构亦明显改变;598位T→C(162位Val→Ala)突变2例,但2者蛋白质二级结构无明显改变;2例Ⅲ级星形细胞瘤分别有2个和3个突变位点,但其各有1个相应的氨基酸未发生变异。Ⅱ级以下脑胶质瘤及脑膜瘤、垂体瘤等良性脑肿瘤组织均未发现DNApolβ基因突变。1例肺癌脑部转移性鳞状细胞癌DNApolβ基因出现5个突变位点,737位A→C(208位Pro未变异)、744位T→G(211位Lue→Val)、830位C→G(239位Cys→Trp)、866位A→C(251位Pro未变异)、870位A→C(253位Arg未变异),但蛋白质二级结构未改变。蛋白质三维结构图显示脑胶质瘤组织中6个氨基酸变异位点中,5个位于掌部,1个位于拇指部。结论:脑胶质瘤细胞中存在DNApolβ基因突变,且这些突变位点均为DNApolβ基因(尤其是掌部)活化结构域。提示脑胶质瘤的发生和发展可能与DNApolβ基因突变有关。

人食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变特点分析

目的 :探讨人食管癌DNA聚合酶beta (polβ)基因突变的特点。 方法 :对 75例人食管癌组织及 4例正常对照组织中提取总RNA ,进行RT PCR ,对PCR产物克隆后以Sanger’s法测序。结果 :人食管癌标本的polβ基因突变率 36 % (2 7/ 75 )。突变形式包括 :①A :G转换 ,突变频率为 6 6 .7% (18/ 2 7) ,375位的A→G (Ile→Val)、4 6 6位G→A(Gly→Glu)、6 6 0位A→G (Arg→Gly)、6 70位A→G(Glu→Gly)、74 0位A→G (Lys未改变 ) ;②T :C转换 ,突变频率 18.5 % (5 / 2 7) ,4 5 4位T→C(Phe→Ser)、6 6 5位T→C (Gly未改变 ) ;③G :T颠换 ,突变频率 18.5 % (5 / 2 7) ,4 6 2位G→T (Glu→提前终止于 116aa) ;④A :T颠换 ,突变频率 18.5 % (5 / 2 7) ,6 13位A→T(Lys→Ile)、737位A→T(Pro未改变 ) ;⑤G :C颠换 ,突变频率 7.4 % (2 / 2 7) ,6 4 8位G→C(Gly→Arg) ;⑥ 177～ 2 34位的 5 8bp缺失 ,移码及提前终止 ,突变频率为 37% (10 / 2 7)。结论 :人食管癌组织 polβ基因突变具有以下特点 :①标本突变率达 36 %(2 7/ 75 ) ;②有以A :G转换和G :T颠换为热点等多种突变形式 ;③ 2种提前终止可产生 2种截短的polβ蛋白 ,1种具有 116氨基酸长度 ;另一种 5 8bp的缺失者仅有 2

前列腺癌及良性增生组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的:研究前列腺癌(Pca)及良性前列腺增生(BPH)组织中DNA聚合酶β基因(polβ)的突变情况.方法:采用RT-PCR、DNA序列分析技术对12例Pca及20例BPH组织中的polβ进行检测,并利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据.结果:Pca组织中polβ突变率为4/12,BPH组织中polβ突变率为1/20.突变形式如下:①点突变:325位A→G转换(71位Glu→Gly),721位A→G转换(203位Glu→Gly),768位C-→T转换(219位Gln→终止码),801位A→G转换(230位Lys→Glu),853位A→G转换(247位Glu→Gly),1071位A→G转换(320位Phe→Leu),177.188位CT→AA(22位Leu→Asn).②58 bp片段缺失(181～238位),导致移码及提前终止.结论:Pca组织中polβ的突变以点突变A→G转换为主要突变形式.181～238位的58 bp的大片段缺失系国内外首次发现的突变形式.DNA polβ突变可能与Pca的发生、发展密切相关.

DNA聚合酶β基因启动子在食管癌组织中的突变分析

目的:研究人食管癌组织、癌旁组织及其远端正常黏膜组织中DNA聚合酶β(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的突变情况.方法:采用聚合酶链反应(PCR)、DNA序列分析技术对25例食管癌患者手术切除的病变标本进行DNApolβ基因启动子序列检测,并利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据.结果:25例中,食管癌组织、癌旁组织和正常黏膜组织中DNApolβ基因启动子发生突变者分别为8、6、5例,三组间突变率差异无统计学意义.在三组标本中共有35个突变点(癌组织包括18个突变点,癌旁组织包括9个突变点,正常黏膜组织8个突变点),25个点在polβ核心启动子区域,其中,-37位C→A突变出现8次;-65位G→T突变出现7次;29位T→C突变出现2次;-19位出现C的缺失和插入C突变各1次.结论:DNApolβ基因启动子突变可能与食管癌的发生和发展有关.

鼻咽癌组织中DNA聚合酶β基因的突变

目的研究鼻咽癌中是否存在DNA聚合酶β(DNA poly meraseβ,polβ)的突变及变异情况。方法采用RT-PCR法(逆转录-DNA聚合酶链反应)、PCR-SSCP(聚合酶链-单链构象多态性分析)、DNA序列分析法对26例鼻咽癌组织进行polβ基因突变研究。结果鼻咽癌组织中存在polβ基因突变,且基因突变率与癌组织的病理分级有关,高分化(G1)、中度分化(G2)、低分化及未分化(G3)鼻咽癌组织中polβ基因突变率分别为12.5%(2/16)、21.4%(3/14)、80%(8/10)。G1与G2比较,差异无统计学意义(P>0.01),G1与G3、G2与G3比较,差异均有统计学意义(P<0.005)。测序结果表明,polβ基因的第454位核苷酸由T变为C,其氨基酸变异为第114位氨基酸由Phe变为Ser;第466位核苷酸由G变为A,其氨基酸变异为第118位氨基酸由Gly变为Glu;第148位核苷酸由A变为G,其氨基酸变异为第28位氨基酸由Asn变为Ser。结论发现在鼻咽癌组织中存在多种形式的polβ突变,导致氨基酸序列、空间结构的改变,可能与鼻咽癌的发生、发展相关。

利用套叠PCR和高保真DNA聚合酶进行基因多位点突变的研究

利用套叠PCR和高保真DNA聚合酶对人工合成的牛口蹄疫病毒VPI基因(FMDV-VPl,Foot-Mouth Disease Virus-VPl)的5个突变位点进行修复,修复的成功率为100％。

非食管癌高发区食管癌组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的 :探讨非食管癌高发区病例的食管癌组织中聚合酶 β基因的突变情况。 方法 :利用RT PCR、SSCP及DNA序列分析的方法 ,对河南省非食管癌高发区 2 5例食管癌及其癌旁组织中聚合酶 β基因的变异情况进行分析。结果 :2 5例食管癌组织标本中 ,5例SSCP结果异常 ,序列分析显示 ,1例 6 13位A→T ,导致氨基酸序列 16 7位Lys→Ile ;2例 6 6 0位A→G ,导致第 183位Arg→Gly ;2例 6 70位A→G ,导致 186位Glu→Gly ;而对应的癌旁组织标本SSCP结果均无异常。结论 :非高发区食管癌组织中有 polβ突变存在。

前列腺癌特异突变DNA聚合酶β真核表达载体构建及鉴定

目的构建前列腺癌(PCa)特异突变DNA聚合酶β(polβ)真核表达载体。方法提取有特异DNApolβ突变的PCa组织的总RNA,通用引物逆转录成cDNA;用设计带有接头的DNA polβ全基因引物,PCR扩增PCa组织中呈现的突变型DNApolβ全基因;构建T-A克隆并进行重组体的筛选鉴定;亚克隆入表达载体pcDNA3.1并进行重组体的筛选和鉴定。结果PCa特异突变DN Apolβ基因扩增选择出P4(M1-polβ)和P5(M2-polβ)两个标本,构建重组有特定突变位点的polβ目的基因的pcDNA3.1真核表达载体,经PCR扩增获得2个阳性集落。结论经鉴定成功构建2例PCa特异突变DNApolβ真核表达载体(pcDNA3.1-M1 and pcDNA3.1-M2)。

利用Pyrobest DNA聚合酶一步法进行大片段基因的定点突变

目的:介绍一种简单、快速、高效和经济的进行大片段基因定点突变的方法。方法:小量抽提含有NM23H1-EGFP融合基因的逆转录病毒真核表达质粒pLXSN-NM23H1-EGFP,体外合成突变引物对,利用高保真Pyrobest DNA聚合酶对质粒DNA进行PCR突变反应,然后用DpnⅠ限制性内切酶消化PCR产物以去除模板DNA,取适量消化产物转化大肠杆菌XL1-Blue,随机挑选克隆进行测序筛选、鉴定所需突变株。结果:在NM23H1-EGFP基因中引入了S44A、P96S、H118F、S120G、P96S-S120G等5个替换突变位点及9bp处的插入突变。结论:该方法简单、快速、高效、经济,不须纯化中间产物,不须亚克隆,突变效率几乎为100%,是一种值得推广应用的方法。

互隔交链孢酚对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β的致突变作用

背景:近年来研究发现食管癌细胞中存在DNA聚合酶β的突变。目的:观察互隔交链孢酚对NIH/3T3细胞中DNA聚合酶β基因序列的影响,研究互隔交链孢酚致细胞变异的机制。方法:用不同浓度(2,4,6,8μmol/L)的互隔交链孢酚作用于NIH/3T3细胞,并设置对照组。用RT-PCR法从细胞总RNA中扩增出DNA聚合酶β基因cDNA序列,应用T-A克隆技术,克隆至pGEM-T载体后进行测序,分析其序列变化。结果与结论:2μmol/L互隔交链孢酚处理后的细胞内DNA聚合酶β基因序列无任何变化。而4μmol/L组中DNA聚合酶β基因有1个位点发生突变,8μmol/L组和16μmol/L组中各有2个位点发生突变,此3组的突变存在相同的位点。结果证实,互隔交链孢酚可导致NIH/3T3细胞中的DNA聚合酶β发生点突变,互隔交链孢酚浓度越高,点突变的数量越多,且存在突变活跃位点。

胃癌组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的:了解胃癌组织中DNA聚合酶β(polβ)基因的突变情况。方法:利用RT-PCR、单链构象多态性(SSCP)和序列分析对38例胃癌组织及其相应癌旁正常组织标本polβ基因进行检测。利用DNASIS、OMIGA等软件分析测序数据,Chou&Fasman算法推测polβ氨基酸序列二级结构。结果:38例胃癌组织标本中SSCP异常9例(23.7%);而对应的癌旁正常组织均未见异常。polβ在低分化胃癌中的突变率达57.1%(8/14),而在中、高度分化胃癌中的突变率为4.2%(1/24),差异有统计学意义(P<0.05)。突变分别为196位A→G(28位Asn→Ser),268位A→G(52位Lys→Arg),790位A→T(226位Asp→Val)。其中196位A→G突变可导致polβ酶蛋白的二级结构明显改变。结果:胃癌组织中的polβ基因突变可能与胃癌的发生、发展有关。

DNA聚合酶β基因在鼻咽癌中的突变

目的探讨鼻咽癌中DNA聚合酶β(DNApolymeraseβ,polβ)的变异情况。方法采用RT -PCR法(逆转录DNA聚合酶链反应)、PCR SSCP(聚合酶链单链构象多态性分析)、DNA序列分析法对2 6例鼻咽癌组织及癌旁组织标本进行polβ基因突变研究。结果在2 6例癌旁组织标本中polβ无突变;2 6例鼻咽癌组织标本中存在polβ基因变异的有8例,突变率为30 8%。polβ基因变异的鼻咽癌标本测序结果显示:核苷酸序列有多种形式的改变。结论在鼻咽癌中存在多种形式的polβ突变,导致氨基酸序列、二级空间结构的改变。

宫颈癌组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的 :观察宫颈癌组织中DNA聚合酶 β基因 (polβ)突变的情况。 方法 :利用RT PCR、SSCP及DNA序列分析法 ,对 18例正常宫颈组织和 2 1例宫颈癌组织 (Ⅰ～Ⅱ期 10例 ,Ⅲ～Ⅳ期 11例 )标本中polβ基因的突变情况进行分析。结果 :8例宫颈鳞癌组织 (8/ 2 1)发现SSCP异常 ,正常宫颈组织无SSCP异常。 2例正常宫颈组织 polβ基因片段测序结果完全正确 ,而 2例SSCP异常的癌组织 polβ基因在 6 6 0位核苷酸由A变为G。polβ在Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期宫颈癌中突变率分别为 10 % (1/ 10 )和 6 3.6 4 % (7/ 11) ,2者间差异有统计学意义 (P =0 .0 2 4 )。结论 :宫颈癌中存在DNA聚合酶 β基因突变现象 。

食管癌点突变型DNA聚合酶β与绿色荧光蛋白重组表达载体的构建

目的 构建携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组真核绿色荧光蛋白表达载体p EGFP-C3- polβ。方法 运用PCR方法,从质粒pc DNA3.1- polβ中扩增出点突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,T- A克隆至p GEM- TEasy载体,再定向克隆至p EGFP- C3真核绿色荧光蛋白表达载体,重组质粒p EGFP- C3- polβ用限制性内切酶酶切和通用鉴定引物PCR扩增鉴定,并进行DNA序列分析。结果 DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列与已知的点突变型DNA聚合酶β基因序列相符。结论 成功构建了携带食管癌点突变型DNA聚合酶β基因的重组的荧光蛋白表达载体p EGFP- C3- polβ,为DNA聚合酶β基因的体内外表达及蛋白定位提供了理想的标记。

野生型DNA聚合酶β转染Eca-109细胞后增变基因表型变化

目的:探讨野生型DNA聚合酶β(polbeta)转染人食管癌Eca-109细胞后对其增变基因表型的效应。方法:将经过鉴定的重组pcDNA3.1质粒(插入野生型,wt)-polbeta转染培养的人食管癌Eca-109细胞。将Eca-109细胞分为3组:转染实验组(E)、空质粒转染对照组(C1)和未转染对照组(C2)。应用原位杂交技术显示wt-polbeta和wt-p53的杂交信号,免疫细胞化学染色显示POLB-免疫反应性(IR)和多药耐受(MDR1)-IR,免疫印迹显示wt-polbeta和突变(mt)-polbeta的带型,细胞化学技术检测各组细胞的增殖与分化细胞的比率。结果:polbeta免疫印迹结果显示E组呈现增强的wt-polbeta主带,C1、C2组呈现很弱wt-polbeta主带和显著突变的(mt)-polbeta主带(P<0.01);polbeta免疫细胞化学结果显示E组的强信号定位于细胞核内,C1、C2组信号皆很弱(P<0.01)。E组的wt-polbeta及wt-p53原位杂交的信号强于C1、C2组(P<0.01)。E组MDR1的免疫反应性和增殖与分化细胞的比率低于C1、C2组(P<0.01)。结论:wt-polbeta转染的Eca-109细胞呈现wt-polbeta及wt-p53表达上调而mt-polbeta及MDR1表达下调的增变基因表型减弱。

宫颈癌组织中DNA聚合酶β基因突变检测

目的 :探讨宫颈癌组织中有无DNA聚合酶 β基因 (polβ)突变。 方法 :采用RT -PCR法、PCR -SSCP分析法对 12例正常宫颈组织、18例宫颈上皮内瘤样病变 (CIN)及 34例宫颈鳞癌组织进行polβ突变检测。 结果 :CIN及宫颈癌组织中存在polβ突变 ,宫颈癌组织中的突变率 (13/ 34)高于CIN(2 / 18) ,后者高于正常宫颈组织。测序结果表明宫颈癌组织中polβ 6 6 0位发生A→G突变。 结论 :宫颈癌组织中的DNA聚合酶